Small Methods：細胞外囊泡表面聚糖的多樣性，影響細胞攝取和體內生物分布

細胞外囊泡（EV）的蛋白和核酸已有很多報道進行過研究，但對EVs異質性和功能有重要影響的EV表面聚糖仍缺乏系統研究。近日，京都大學的研究人員在Small Methods雜志（IF 14.188）上發表文章，報道了不同細胞、不同EV亞群的表面聚糖的特征，并對EVs表面聚糖進行修改后發現，不同的聚糖形式會影響EV的細胞攝取和體內生物分布。

細胞間通訊在我們體內不斷進行，通過各種方式發送和接收生物信息，包括直接的細胞接觸，如配體-受體相互作用，以及間隙連接介導的信號傳導，釋放生長因子、細胞因子和趨化因子等分子，以及細胞外基于囊泡（EV）的生物活性分子遞送。EVs是由脂質雙層包圍的納米到微米大小的囊泡，由所有類型的哺乳動物細胞釋放，作為一種新型的細胞間通訊工具在各個領域，尤其是疾病的診斷、預后和治療中引起了人們的關注。

EV生物發生大致可分為三種類型：1）細胞凋亡過程中釋放的凋亡小體，2）直接從質膜出芽的脫落囊泡（微囊泡），以及3）稱為外泌體的內體衍生的囊泡。有研究使用不對稱場流分級方法發現了極小的（≈35nm）非膜顆粒（外泌顆粒）（https://www.exosomemed.com/4061.html）。小型EV（sEV；直徑對EV異質性的研究仍然不足。

對于EV分離，超速離心是收集幾乎所有EV亞型的金標準，密度梯度有時用于分離特定的密度組分。此外，已通過免疫親和捕獲方法和尺寸排阻色譜法分離出EV富含的分子（例如，四跨膜蛋白和脂質）。四跨膜蛋白陰性EVs（直徑150-1000nm）表達膜聯蛋白A1，通過結構照明顯微鏡觀察到膜聯蛋白A1陽性EV出芽，這表明膜聯蛋白A1在脫落的囊泡中特異性表達。磷脂酰絲氨酸(PS)富含于EV，可用于免疫親和方法，這取決于細胞類型、囊泡大小和癌癥進展。有研究收集了不同PS含量的sEV，發現它們在密度、尺寸和表面電荷方面存在差異。此外，其他研究表明，EV亞型之間的蛋白質和miRNA譜不同，這表明了解每個EV亞型的功能并標準化其分離方法以用于臨床應用非常重要。

盡管如上所述EV亞型的差異已通過EV蛋白、核酸和脂質來表征，該研究將EV表面聚糖作為一種新的EV異質性指標進行了關注。蛋白質和脂質是細胞膜的重要組成部分，它們中的大多數分別以糖蛋白和糖脂的形式存在。聚糖與各種生物和病理過程有關，它們當然在EVs中發揮著重要作用。在過去10年中，人們對EV表面聚糖的興趣有所增加，例如它們對細胞相互作用和生物分布的影響、作為生物標志物的應用以及用作EV亞群的指標。

作者之前報道了間充質干細胞(MSC)衍生的EV表面聚糖在細胞攝取中起重要作用，并且使用消失場熒光(evanescent field fluorescence, EFF)輔助凝集素微陣列可以將EV聚糖模式用作MSCs的成骨分化標志物。這種方法的優點是省略了預處理和后處理過程。因此，只需制備熒光標記的EV并檢測EV結合凝集素信號，無需洗滌步驟。此外，可以在1天內使用極少量的EV樣品（≈0.5μg）對多個EV樣品進行綜合分析。因此，作者假設該方法適用于表征EV異質性。

一些研究報告稱，EV表面聚糖譜有助于定義每種EV亞型。有研究通過凝集素印跡分析和質譜法比較了三種不同大小EV的聚糖模式，包括來自三種細胞系的外泌體、小型EV（60-80nm）和大型EV（90-120nm）（https://www.exosomemed.com/4061.html）。結果揭示了依賴于細胞類型和EV亞型的不同聚糖譜。另一項研究使用凝集素微陣列比較了來自兩個細胞系的EV的聚糖譜，并確定了幾種在它們之間具有不同結合信號的凝集素。

EV表面聚糖在EV異質性和細胞-EV相互作用中的作用

在這項研究中，作者使用EFF-凝集素陣列根據其細胞類型、大小和分離方法對EV表面聚糖進行了更詳細的比較，以評估EV聚糖譜是否可以用作EV亞群的指標（圖1）。此外，使用糖苷酶和糖基轉移酶進行EV糖工程，制備具有四種不同表面聚糖模式的EV，并評估其細胞攝取效率。研究確定了在每種實驗條件下獲得的EV上聚糖模式的相似性和差異。具體來說，獲得了依賴于EV大小和分離方法的特定凝集素結合模式，并且EV的細胞攝取行為受到受體細胞和EV聚糖譜的影響。研究還發現EV的體內生物分布取決于它們的聚糖。這項研究表明，EV表面聚糖為EV異質性提供了一種潛在的新指標，而糖工程是操縱EV-細胞相互作用的有用技術。

使用凝集素微陣列對來自20個細胞系的sEV進行聚糖分析

PC3細胞衍生EV的表征

來自PC3細胞的EV的聚糖譜

使用糖苷酶和糖基轉移酶修改EV表面聚糖

靜脈注射24小時后小鼠體內糖工程ADSC-sEVs的體內生物分布

參考文獻：

ShimodaA, Miura R, Tateno H, Seo N, Shiku H, Sawada SI, Sasaki Y, Akiyoshi K.Assessment of Surface Glycan Diversity on Extracellular Vesicles by LectinMicroarray and Glycoengineering Strategies for Drug Delivery Applications.Small Methods. 2022 Feb;6(2):e2100785. doi: 10.1002/smtd.202100785. Epub 2021Dec 1. PMID: 35174988.