信不信？高效分離外泌體，幾小時就能搞定！附外泌體數據庫

外泌體是包含了復雜 RNA 和蛋白質的小膜泡 (30-150nm)。所有培養的細胞類型均可分泌外泌體，且外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。有關他們分泌和攝取及其組成、“運載物”和相應功能的精確分子機制則剛剛開始研究。外泌體目前被視為特異性分泌的膜泡，參與細胞間通訊。無論是對其功能，還是對如何將其用于微創診斷的開發的研究都日益增長。

外泌體的功能

研究發現外泌體在很多生理病理上起著重要的作用，如免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復等。不同細胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標志物。外泌體具有脂質雙層膜結構，能很好的保護其包被的物質，且能靶向特定細胞或組織，因此是一種很好靶向給藥系統。

外泌體中包含多種成分，如蛋白質、脂質、RNA，其中RNA種類有：mRNA、miRNA及其他非編碼RNA。

具體功能：

?有助于細胞成熟過程中等離子體膜蛋白的移動

?傳遞大分子信息(RNA和蛋白質)，使細胞間信息傳遞

?促進免疫反應、抗原呈遞、程序性細胞死亡、血管生成、炎癥反應、凝聚

?腫瘤細胞分泌的外泌體可促進致癌基因的傳播

?在極性產物的生長和分化期間形成轉運蛋白

?朊病毒等病原體的傳播以及病毒的細胞間傳播

?通過分泌化學誘導信號幫助網柄菌細胞遷移

?母乳中包含miRNA的外泌體，有助于增強嬰兒免疫系統

近年來，關于外泌體的研究與應用十分熱門，今天小編就來給大家普及一下外泌體研究中的第一步：如何高效提取分離外泌體？以及分享一些外泌體數據庫。

1超速離心法

超速離心法是目前最常用的外泌體純化手段，通過高速離心將大小相同的囊泡從樣本中沉淀并純化出來。

外泌體超速離心一般和蔗糖密度梯度離心或蔗糖襯墊組合起來分離低豐度外泌體。需在離心機中以100,000-200,000 x g離心沉淀（含有外泌體）120分鐘，使樣品中的外泌體在1.13-1.19g/mL的蔗糖密度范圍內進行富集。

盡管這種聯合的方法可以獲得高度純化的外泌體，但也存在一些缺點。例如同批次最多只能同時處理6個樣本（轉子限制）且回收率不穩定，前期需要準備大量材料且外泌體得率低。

最重要的是重復離心很可能對外泌體的囊泡造成損害從而降低其質量，并且一些可溶性蛋白可與外泌體形成團塊而產生污染。

2超濾離心法

 

超濾離心法是利用不同截留相對分子質量(MWCO)的超濾膜進行選擇性分離，小分子物質會被過濾到膜的另一側，而大于膜孔徑的高相對分子質量物質則截留在超濾膜上。

這種方法比較簡單高效，也不影響外泌體的生物活性，但缺點是外泌體可能會阻塞過濾孔，導致膜的壽命減短，分離效率較低。此外，截留在膜上的外泌體間也會發生粘附，導致產量降低。

Tips：外泌體是直徑30~100 nm囊狀小體，大于一般蛋白質。采用此方法需要考慮到與外泌體大小相似的其他囊泡的干擾。

3PEG-base沉淀法

聚乙二醇（PEG）可與疏水性蛋白和脂質分子結合共沉淀，早期應用于從血清等樣本中收集病毒，現在也被用來沉淀外泌體，其原理可能與競爭性結合游離水分子有關。在4℃利用PEG孵育后通過過濾或離心即可沉淀、回收外泌體。

采用此種分離方法也存在不少問題：純度和回收率低，雜蛋白較多（假陽性），顆粒大小不均一，產生難以去除的聚合物，機械力或者吐溫-20等化學添加物將會破壞外泌體等，因此發表文章時易受質疑。

4磁珠免疫法

 

外泌體表面有其特異性標記物（如CD9，CD81，CD63，CD82，Hsp70，Ras相關蛋白Rab-5b，細胞骨架蛋白肌動蛋白和TSG101等），用包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結合，即可將外泌體吸附并分離出來。

因為外泌體的異質性與它們的起源一致，不同外泌體上的標記物豐度也不同，通過特定的抗體組合可以從樣本中捕獲不同類型的外泌體，進行選擇性分離。

磁珠法具有特異性高、操作簡便、不影響外泌體形態完整等優點，但是效率低，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實驗，難以廣泛普及。

其他方法（近期文獻報道）

①交流電動（alternating current electrokinetic，ACE）微陣列芯片裝置：簡稱ACE芯片，該芯片的單個電極的側視圖和俯視圖如下所示，一個設備中有超過1000個電極，其表面涂覆薄薄一層多孔水凝膠，圖中虛線所示DEP高場區即外泌體被富集的位置。在芯片電極處被富集的外泌體可直接用掃描電子顯微鏡（SEM）和免疫熒光等方法進行分析與鑒定。

該裝置可以從未稀釋的人血漿樣品中快速分離獲取外泌體，需要的樣品量小，在15分鐘內將外泌體集中到微電極周圍的高場區域。洗滌去除大量血漿物質后，使外泌體濃縮在微電極上。分離、洗滌及芯片熒光分析步驟在30分鐘內就可以完成。

參考文獻：Ibsen SD, Wright J, Lewis JM, et al. Rapid Isolation and Detection of Exosomes and Associated Biomarkers from Plasma[J]. ACS nano, 2017.

②基于新型聲波流體技術（acoustofluidic technology）開發的聲波篩選裝置：細胞分選裝置由一個微流體通道和兩端的聲換能器組成。

兩個聲換能器生產的聲波相互接觸所形成的駐波會生成一系列壓力節點。當細胞或粒子流過通道并遇到一個節點時，壓力會引導細胞稍微偏離中心，細胞位移的距離取決于細胞大小和可壓縮性等其他性質。

為了分離外泌體，研究人員將2個上述裝置串聯。第一個裝置用來去除血液樣本中的細胞和血小板，第二個裝置的聲波頻率較高，可以把剩余血液樣本中的更小的外泌體與稍大的胞外囊膜分離開來。利用這種裝置完成100ml稀釋血液樣本的篩選工作用時不到25分鐘。

參考文獻：Wu M, Ouyang Y, Wang Z, et al. Isolation of exosomes from whole blood by integrating acoustics and microfluidics.[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2017, 114(40):201709210.

 

外泌體研究數據庫

外泌體的研究方向包括基礎機制研究及臨床應用研究，涉及腫瘤、免疫、代謝、神經調控等多個領域。在臨床診斷和治療方面展現出了極具前景的研究價值，因此也是近年來的研究熱點之一。本著便利、全面、高效的原則，來看看外泌體的數據庫大匯總吧！

01

EVmiRNA

EVmiRNA

EVmiRNA數據庫，是一個專用于細胞外囊泡（EVs）的miRNA數據庫。里面包括miRNA表達譜，miRNA相關藥物，miRNA調控途徑，miRNA功能以及相關出版物。收錄了17種器官或疾病462個EVs小RNA測序樣本miRNA表達譜。EVmiRNA提供了三個功能模塊：

(1)不同來源(如血液、母乳等)的miRNA表達譜和樣本信息；

(2)在不同EVS中特異表達的miRNA，有助于生物標志物的識別；

(3)miRNA注釋，包括miRNA在EVS和TCGA中的表達，miRNA途徑的調控，以及miRNA的功能和出版物。

02

exoRBase

exorbase.org/

exoRBase是從人類血液外泌體的RNA-seq數據分析得出的環狀RNA（circRNA），長非編碼RNA（lncRNA）和信使RNA（mRNA）的存儲庫。exoRBase旨在收集和表征人血外泌體中的所有長RNA種類來提供注釋，表達水平和可能的原始組織，識別血液外泌體中的分子標記，并將觸發新的循環生物標志物發現以及對人類疾病的功能預測。

03

ExoCarta

exocarta.org/

ExoCarta是首個外泌體標志物綜合數據庫，針對外泌體中鑒定出的蛋白質和RNA分子數據庫由Simpson教授團隊建立，收錄了包括人、大鼠、小鼠、綿羊、豚鼠、果蠅、馬、穴兔、牛在內的幾個物種共286個研究結果。除此之外，ExoCarta的一個典型特點就是具有外泌體蛋白動態的蛋白與蛋白之間相互關系網以生物學通路。

04

EV-TRACK

evtrack.org

EV-TRACK是以Thery為首的EV-TRACK聯盟建立的EVs（EVs細胞外囊泡主要分為外泌體、微囊泡（microvesicles，MV）和凋亡小體三大類）研究報告數據庫，其中包含了EVs相關文獻的方法學參數，基于MISEV（EVs研究最小實驗要求）評估EVs分離及鑒定相關參數。該數據庫的建立旨在規范EVs研究，便于將實驗規范應用于實際研究中，對實驗結果進行解釋，目前的數據包括了1502個出版物和2660個實驗，且每年都在不停的更新中。

05

EMBL-EBI QuickGO

ebi.ac.uk/QuickGO/

QuickGO數據庫一款針對人類蛋白GO功能分析的綜合注釋數據庫，和實驗室研究人員及外泌體數據庫Exocarta 和Vesiclepedia是有緊密合作，其中有識別用于注釋的靶蛋白以及外泌體實驗方法學的注釋，外泌體蛋白功能注釋。而且外來基因本體論注釋倡議就是由EBI的UniProt策劃人發起，通過閱讀文獻并為這些蛋白指定描述其生物學作用的術語，將GO注釋分配給人類外泌體蛋白。之前有專用于exosome的小庫，但現在網頁已經失效了，相關數據也綜合到了QuickGO里。

06

Vesiclepedia

microvesicles.org/

Vesiclepedia是一個EVs分子數據（脂質、RNA和蛋白質）的數據庫，目前包含來自于過去一些年份文獻中發表的341個獨立研究的35264個蛋白，18718個mRNA，1772個miRNA、342個脂質條目，Apoptotic blebs凋亡小泡、Exosomes 外泌體、Microparticles 微粒體 、Microvesicles 微囊泡都囊括在內。還可以根據物種、囊泡、分子和樣品類型瀏覽和檢索，這些條目來自過去幾年發表的341項獨立研究。

07

Urinary Exosome Protein Database

hpcwebapps.cit.nih.gov/

Urinary Exosome Protein Database是專用于尿液外泌體蛋白的數據庫， 庫內有1160種蛋白質，里面的數據是基于上皮系統生物實驗室（ESBL）已發表的蛋白質譜數據，所有數據均來源于健康志愿者尿液外泌體。這個數據庫包含了用兩種不同的質譜儀來鑒定人類尿外泌體的蛋白質。

08

exRNA Atlas

exrna-atlas.org/exat

exRNA Atlas是ERCC聯盟的數據庫，有6627個數據。exRNA Atlas是細胞外RNA通訊聯盟（ERCC）的數據庫。該信息庫包括人類和小鼠生物流體的小分子RNA測序和qPCR衍生的exRNA圖譜，數據庫使用exceRpt小RNA-seq管道的版本4處理所有RNA-seq數據集，并且ERCC開發的質量指標被統一應用于這些數據集。具體來說囊括了腦脊液、唾液、血清、血漿和尿液來源的5,309例 exRNA-seq 以及qPCR數據，同時網站還提供了適用于exRNA研究的分析工具。

09

miRandola

mirandola.iit.cnr.it/

miRandola是對各種細胞外循環非編碼RNA類型進行全面的人工分類的數據庫。非編碼RNA以高度穩定的細胞外形式在血液中循環，在調節各種生物過程中起重要作用，因此它們可用作基于血液的生物標記。miRandola數據庫目前有314條3283個條目，7種細胞外RNA形式，1002個microRNA，12個長非編碼RNA，8個環狀RNA，最重要的是對Vesiclepedia和ExoCarta miRNA數據整合。

參考文獻：

1. Progress in Exosome Isolation Techniques（doi: 10.7150/thno.18133）

2. https://bitesizebio.com/37981/beginners-guide-hunting-exosomes/