林英豪教授分享｜干細胞來源的外泌體：一種逆轉皮膚老化的新方法

中國中醫科學院針灸研究所北京國際針灸培訓中心客座教授

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皮膚老化可分為內在老化和外在老化。內在老化是指正常的皮膚老化，并隨著年齡的增長而逐漸發生，主要特征是皮膚干燥、細皺紋、膠原蛋白和彈性纖維減少，皮下脂肪更薄。外部老化是由環境因素引起的，特別是紫外線，可表現為皮膚干燥、溝大而深、皮膚無彈性、皮膚粗糙、色素沉著不均等。

角質形成細胞增殖和分裂能力下降、成纖維細胞功能異常、乳頭狀層變平、ECM成分和含量的變化是內源性和外源性皮膚衰老過程中常見的病理生理變化。

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干細胞移植在抗衰老治療領域具有廣闊的應用潛力。在體內植入干細胞顯著延緩了衰老，但令人驚訝的是，植入的干細胞沒有在組織中檢測到。這表明其抗衰老作用可能是通過旁分泌活性來實現的。外泌體是參與細胞旁分泌的最重要的結構（一種直徑為50-150 nm的小膜泡，內含核酸、蛋白質和脂質等多種活性成分），作為一種無細胞治療的替代方法受到廣泛關注。

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干細胞（SCs）來源的外泌體避免了干細胞移植中免疫排斥、干細胞維持、細胞衰老和腫瘤發生的風險。其通過參與細胞-細胞通信來影響一系列的病理生理過程，在組織損傷修復、慢性傷口愈合、抑制傷口瘢痕形成和抗衰老方面發揮作用。

01. 外泌體對表皮細胞功能的影響及分子機制

表皮是哺乳動物皮膚的最外層，由多層上皮細胞、濾泡間表皮組成，并伴有毛囊、皮脂腺和小汗腺。表皮主要由角質形成細胞組成（95%）。表皮的維持依賴于表皮干細胞的增殖，表皮干細胞具有廣泛的自我更新能力和能夠產生經過進一步分化的子細胞。

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由誘導多能干細胞所衍生的間充質干細胞來源的外泌體（iMSC-Exo）通過刺激ERK1/2促進人類永生化表皮細胞（HaCaTs）和人真皮成纖維細胞（HDFs）的增殖。

脂肪間充質干細胞來源的外泌體（ADSC-Exos）可通過Wnt/β連環蛋白信號通路促進HaCaT細胞的增殖和遷移，并抑制其細胞凋亡；還通過激活Akt/HIF-1a信號通路，促進HaCaT細胞的增殖和遷移，從而促進傷口愈合。

人臍帶間充質干細胞來源的外泌體（hucMSC-Ex）保護皮膚角質形成細胞免受氧化應激，并傳遞14-3-3f蛋白，促進氧化應激條件下HaCaT細胞中SIRT1的表達。表皮干細胞衍生的外泌體通過下調傷口愈合中的轉化生長因子-β1來促進皮膚再生。

02. 外泌體對成纖維細胞功能的影響及分子機制

成纖維細胞是真皮的主要細胞成分，其功能受損和由此產生的細胞外基質（ECM）變化與外源性皮膚老化密切相關。

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來自人臍帶血漿的外泌體可以將miR21-3p轉運到細胞中，下調磷酸酶和緊張蛋白同源物（PTEN）和芽狀同源物1（SPRY1）的表達，從而激活PI3K/ Akt和ERK1/2信號通路，調節細胞功能。

含有miR-26a的人骨髓間充質干細胞來源的外泌體可抑制高糖誘導的人皮膚成纖維細胞（BJ細胞）的增殖、遷移和轉分化，促進細胞凋亡，這可能與TLR4/NF-κB信號通路有關。

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除mRNA外，外泌體中的細胞因子也在調節成纖維細胞的功能中發揮作用。例如，外泌體中的血小板衍生生長因子（PDGF）可以被傳遞到成纖維細胞并與相應的受體結合，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路被激活，促進細胞增殖。

誘導多能干細胞來源的外泌體可以以濃度依賴性的方式促進成纖維細胞的增殖，并通過降低SA-β-Gal的表達來逆轉UVB誘導的成纖維細胞衰老。

臍帶間充質干細胞來源的外泌體（USC-CM-Exos）具有多種與皮膚年輕化相關的生長因子，體外實驗結果顯示，USC-CM-Exos與HDFs整合，從而促進人真皮成纖維細胞（HDFs）的細胞遷移和膠原合成。

03. 外泌體對基質金屬蛋白酶（MMP）的作用及分子機制

基質金屬蛋白酶是生物體中普遍存在的肽鏈酶，而皮膚中最重要的基質金屬蛋白酶是MMP1、MMP3和MMP9，這些酶幾乎可以降解真皮細胞外基質中的所有分子，特別是構成真皮結構的膠原蛋白和彈性蛋白纖維。

在內源性和外源性皮膚衰老過程中，MMP的表達和活性已被證明有所增加。人皮膚暴露于UVB照射下，通過上調角質形成細胞和成纖維細胞中的轉錄因子AP-1和NF-B，誘導MMP的表達和激活。

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TIMPs通過非共價結合的相互作用選擇性地抑制MMP活性。研究發現，來自人真皮干細胞的條件培養基可以降低衰老成纖維細胞中MMP1的表達，并能上調這些細胞中的TIMP1。進一步的體外實驗顯示，干細胞外泌體不僅下調了自然衰老的成纖維細胞中MMP的表達，而且還顯著抑制了UVB誘導的成纖維細胞中MMP1和MMP3的過表達。

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外泌體表面攜帶的MMP1、MMP2、MMP3、MMP9和MMP13通過調節ECM的結構，為新形成的血管和血管相關的遷移細胞創造空間，促進新的血管生成和傷口修復。

脂肪源性干細胞（ADSC）的外泌體可顯著減少角膜基質細胞中MMP1、MMP2、MMP3和MMP9的分泌，這些外泌體可上調細胞外基質相關蛋白，包括四種膠原蛋白和纖維蛋白。

然而，另一項研究發現，ADSC衍生的外泌體通過激活ERK/MAPK信號通路增加了MMP3的水平，而MMP3隨著外泌體濃度的增加而成比例地增加，最終導致過度增殖纖維的降解，以促進傷口愈合而不形成瘢痕。

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這些有趣的結果表明，外泌體對MMP的調控是雙向的。由于ECM合成和降解的慢性失衡，彈性纖維和膠原纖維的損傷加速了真皮結構的破壞，這種分解是皮膚老化的主要分子特征。

04. 外泌體對活性氧的影響及分子機制

ROS是細胞代謝的副產物，例如過氧化氫、超氧陰離子、羥基自由基等。低濃度的ROS參與細胞增殖、分化和信號轉導，這些過程有利于機體。高濃度的ROS會對DNA、蛋白質和脂質造成氧化應激損傷。

紫外線輻射可以產生大量的活性氧來影響真皮成纖維細胞的功能，誘導MMP合成和損傷ECM成分，如膠原蛋白和彈性蛋白。參與ROS代謝的氧化還原反應途徑的異常調控也與衰老有關，衰老的成纖維細胞比正常細胞產生更多的ROS。

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干細胞外泌體在ROS的產生和清除過程中具有一定的功能。

AQP-1和AQP-3在成纖維細胞中的表達和透明質酸的分泌對皮膚具有良好的保濕作用。然而，氧化應激降低了AQP-1和AQP-3 mRNA的表達和透明質酸的分泌，而這可被外泌體逆轉。來自人真皮干細胞/祖細胞的條件培養基通過上調超氧化物歧化酶-2（SOD2）來降低ROS水平。

丙二醛（MDA）是脂質過氧化的標志物，它可以反映細胞毒性損傷的程度。脂肪源性干細胞（ADSC）通過其旁分泌機制，上調SOD和下調MDA水平，從而逆轉半乳糖誘導的皮膚氧化應激。

谷胱甘肽過氧化物酶1（GPX1）是主要的ROS清除酶系統，而煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）是體內關鍵的ROS產生酶系統。研究發現，來自ADSCs的外泌體可以抑制NOX1和NOX2的表達，從而減少ROS的產生。

SIRT1的下調導致過氧化氫誘導的成纖維細胞中乙酰化的p53的表達增加，從而誘導p53下游分子p21的表達，并抑制細胞周期導致細胞衰老。間充質干細胞外泌體（MSC-Exo）增強了這些信號轉導系統，還有效阻斷細胞內SA-β-Gal活性的增加和細胞內ROS的積累。

干細胞來源的外泌體可通過激活MAPK、AKT、STAT3和ERK1/2等信號通路，增強皮膚成纖維細胞（FB）的增殖和遷移能力，促進表皮細胞的增殖，恢復ECM成分，降低ROS水平和抑制MMP的產生，最終逆轉皮膚衰老。

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與再生醫學中基于細胞的治療相比，干細胞（MSC）外泌體治療對臨床發展更有吸引力。首先，MSC外泌體具有少量的主要組織相容性復合體，其免疫原性低于親本細胞，這可能使MSC外泌體在外源宿主中不易引起免疫應答。其次，許多與干細胞移植相關的安全問題和倫理限制可以通過用它們分泌的外泌體取代活細胞來緩解。第三，新的證據表明，外泌體是可原子化的，可以在20℃的溫度下低溫保存6個月而不失去其生理活性。更重要的是，未標記的外泌體沒有引起細胞和生化血液參數的顯著改變，也沒有引起心臟、腎臟、肺、脾臟或肝組織的任何形態學變化。

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基于此，外泌體為抗衰老治療提供了新的希望。然而，外泌體是否能夠完全替代和模擬SCs的功能尚不確定，其分離和純化仍需進一步改進。未來還可能會產生含有特定成分的外泌體用于精確治療，這些巨大的潛在價值都值得我們進一步探索。

參考文獻?

Wu JY, Wu SN, Zhang LP, Zhao XS, Li Y, Yang QY, Yuan RY, Liu JL, Mao HJ, Zhu NW. Stem Cell-Derived Exosomes: A New Method for Reversing Skin Aging[J]. Tissue Eng Regen Med. 2022 Oct;19(5):961-968.