外泌體遞送mRNA成功制備CAR-T！外泌體賽道進(jìn)展頻頻東風(fēng)已至

相對于慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)而言，利用mRNA誘導(dǎo)CAR表達(dá)的方式能允許CAR在短時(shí)間內(nèi)表達(dá)，避免在體內(nèi)存在時(shí)間過長引發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，優(yōu)化CAR mRNA結(jié)構(gòu)能夠使CAR蛋白更易于在T細(xì)胞中翻譯和表達(dá)，且在療效方面并不亞于慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生的CAR-T療法。當(dāng)下常用的將mRNA導(dǎo)入T細(xì)胞的技術(shù)是電穿孔，但高壓電脈沖可能會導(dǎo)致對細(xì)胞的永久損傷，影響CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增和殺傷力。

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2023年2月發(fā)布的一篇名為“Engineered exosome-mediated messenger RNA and single-chain variable fragment delivery for human chimeric antigen receptor T-cell engineering”的文章報(bào)道了國內(nèi)研究人員利用外泌體遞送mRNA以制備CAR-T療法。

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外泌體由活細(xì)胞分泌到細(xì)胞外環(huán)境中，含有多種有生物活性的分子，相應(yīng)的受體可以吸收這些分子并介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊。外泌體的結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，能夠有效保護(hù)mRNA不被降解，已有研究表明誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的外泌體即使在4℃以下也能有效保護(hù)mRNA不被降解。且外泌體的免疫原性較低，具有更好的生物相容性，能夠穿過血腦屏障。此外，外泌體還可以進(jìn)行工程化改造，以增強(qiáng)其靶向性。

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研究人員利用噬菌體外殼蛋白MS2將特定的mRNA裝載到外泌體中，并證明了被包裹的mRNA分子在受體細(xì)胞中能夠被翻譯成功能蛋白。通過與溶酶體相關(guān)膜蛋白2亞型B（LAMP-2B）的N-末端融合，使得CD3/CD28單鏈可變片段（ScFv）能夠在外泌體外膜上表達(dá)。最后再將MS2結(jié)合位點(diǎn)插入到CAR基因的30 UTR以得到能夠直接用于T細(xì)胞活化以及CAR-T細(xì)胞制備的工程化外泌體。

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▲ 外泌體遞送mRNA制備CAR-T

（圖片來源：參考資料1）

在試驗(yàn)中，研究人員證實(shí)了外泌體上的CD3/CD28 ScFv跟易于結(jié)合到T細(xì)胞膜上，并觀察到利用外泌體遞送mRNA所構(gòu)建的CAR-T具有良好的殺傷功效。這或許是一種更加安全有效地向T細(xì)胞遞送mRNA的替代策略，同時(shí)也為體內(nèi)制備CAR-T提供新思路。

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文章中，作者還提到了利用外泌體遞送mRNA以制備CAR-T療法所存在的挑戰(zhàn)，如將mRNA裝載到外泌體的效率，已有研究報(bào)道，將可以結(jié)合特定RNA序列的蛋白質(zhì)融合到外泌體上可以提高mRNA進(jìn)入外泌體的效率，另外通過與陽離子脂質(zhì)預(yù)孵育產(chǎn)生脂質(zhì)包被的純化的mRNA，再與外泌體一起孵育產(chǎn)生攜帶有mRNA的外泌體-脂質(zhì)體雜交體，這也能夠有效提升mRNA進(jìn)入外泌體的效率。

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除了利用外泌體遞送mRNA外，當(dāng)下外泌體還被用于遞送多種物質(zhì)，如siRNA、各種非編碼RNA、CRISPR、蛋白質(zhì)等。近來，外泌體領(lǐng)域取得了不少進(jìn)展。

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2023年2月，NurExone Biologic公布了其在研產(chǎn)品ExoPTEN的臨床前研究中期結(jié)果。ExoPTEN是一種基于外泌體遞送的siRNA藥物，用于治療急性創(chuàng)傷性脊髓損傷（SCI）。

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結(jié)果表明，在由4只接受ExoPTEN鼻內(nèi)給藥的大鼠組成的ExoPTEN治療組中，75%的大鼠對治療有反應(yīng)并恢復(fù)了后肢反射，同時(shí)恢復(fù)了一些運(yùn)動功能和感覺控制。而僅用PTENsiRNA分子治療或僅用外泌體治療的兩組中只有25%的大鼠對治療有反應(yīng)并恢復(fù)了后肢反射、運(yùn)動功能和感覺控制。

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2023年2月，Capricor Therapeutics公布了其基于外泌體的細(xì)胞療法CAP-1002在治療晚期杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）患者的2期臨床試驗(yàn)HOPE-2的最新數(shù)據(jù)。

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CAP-1002是由心臟來源細(xì)胞（CDCs）組成，能夠釋放包含微小RNA、非編碼RNA和蛋白的外泌體，從而可以改善DMD患者肌肉瘢痕或纖維化以及心臟功能。18個(gè)月的數(shù)據(jù)顯示：與原始安慰劑組相比，CAP-1002原始治療組中患者的上肢表現(xiàn)顯著改善，且藥物耐受性良好。

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2023年1月，Capricor公布了其工程化外泌體的最新研究進(jìn)展，基于其專有的StealthX外泌體平臺，打造了兩種基于外泌體的新型新冠疫苗：STX-S和STX-N。無論單藥使用或聯(lián)合使用，均能夠激發(fā)強(qiáng)大的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。

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同月，Nature Biomedical Engineering上發(fā)表了一篇名為“Intradermally delivered mRNA-encapsulating extracellular vesicles for collagen-replacement therapy”的文章，研究人員研發(fā)了一種工程修飾的增強(qiáng)型外泌體，能夠?qū)⒛z原蛋白mRNA遞送到皮膚中促進(jìn)受體皮膚細(xì)胞產(chǎn)生，已在膠原缺失的光老化模型中證實(shí)了EV mRNA用于蛋白質(zhì)替代治療的功效。

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外泌體是一種具有天然優(yōu)勢的遞送工具，具有巨大的臨床應(yīng)用前景，被業(yè)內(nèi)寄予厚望。盡管當(dāng)下外泌體行業(yè)尚處于臨床前研發(fā)階段，從開發(fā)、純化、檢測到標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)環(huán)節(jié)均存在眾多挑戰(zhàn)尚待解決，但隨著研發(fā)的深入和技術(shù)的發(fā)展，外泌體的相關(guān)研究數(shù)量逐漸增加，賽道玩家也在持續(xù)上升，相信未來外泌體的發(fā)展將會更加迅速。

參考資料：

1.Engineered exosome-mediated messenger RNA and single-chain variable?fragment delivery for human chimeric antigen receptor T-cell?engineering