間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體：轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的現(xiàn)代方法

幾十年來，間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs) 憑借其分化能力、強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)特性以及易于培養(yǎng)和操作的能力，在再生醫(yī)學(xué)中引起了極大的關(guān)注。

最近的研究表明，MSCs 的多效作用與其分化能力無關(guān)，而是由可溶性旁分泌因子的分泌介導(dǎo)。外泌體，即納米級(jí)細(xì)胞外囊泡，是這些旁分泌介質(zhì)之一。外泌體將功能性貨物如 miRNA 和 mRNA 分子、肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子和脂質(zhì)從 MSC 轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞。

外泌體參與細(xì)胞間通訊事件并有助于受傷或患病組織和器官的愈合。研究報(bào)告稱，在許多實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校饷隗w本身就是 MSCs 治療效果的原因。因此，可以操縱和應(yīng)用MSC衍生的外泌體來建立一種新的無細(xì)胞治療方法，用于治療各種疾病，包括心臟、腎臟、肝臟、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及皮膚傷口愈合。

與其供體細(xì)胞相比，MSC 衍生的外泌體提供了更穩(wěn)定的實(shí)體，并降低了有關(guān)活細(xì)胞給藥的安全風(fēng)險(xiǎn)，例如。微血管閉塞風(fēng)險(xiǎn)。

間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC)?

間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC) 是亞歷山大·弗里登斯坦 (Alexander Friedenstein) 在研究骨髓時(shí)最初發(fā)現(xiàn)的多能非造血成體細(xì)胞。除了骨髓，MSCs還可以從其他成人組織中分離出來，包括脂肪組織、羊水、牙髓、胎盤、臍帶血、沃頓氏膠，甚至腦、腎、肝、肺、脾、胰腺和胸腺。

MSC 以其分化、自我更新和集落形成的能力而聞名。MSCs 在體外增殖和分化成各種細(xì)胞表型的獨(dú)特能力代表了將它們招募為治療結(jié)締組織壞死或凋亡細(xì)胞的治療劑的絕佳機(jī)會(huì)。

事實(shí)上，MSCs 可以分化成不同的間充質(zhì)來源譜系，包括脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，以及許多非間充質(zhì)譜系，如肝細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞。

令我們驚訝的是，大量研究已證明 MSC 既不能大量移植，也不能持續(xù)足夠長的時(shí)間來解釋組織置換過程。間充質(zhì)干細(xì)胞采用組織修復(fù)的替代模式，并通過誘導(dǎo)細(xì)胞活力、增殖和分化、減少細(xì)胞凋亡和纖維化、刺激細(xì)胞外基質(zhì)重塑以及有時(shí)調(diào)整局部免疫系統(tǒng)反應(yīng)以抑制炎癥來影響其鄰近細(xì)胞，這些替代策略涉及 MSC 和相鄰細(xì)胞之間的旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)，這通過產(chǎn)生和釋放某些營養(yǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子和激素、隧道納米管促進(jìn)的細(xì)胞間相互作用以及分泌細(xì)胞外囊泡 (EV) 等外泌體來促進(jìn)。

源自 MSC 的外泌體通過將活性生物分子（如肽、蛋白質(zhì)和 RNA 種類）包裹和傳送到患病細(xì)胞/組織，促進(jìn)組織再生，從而代表與這些細(xì)胞相似的生物學(xué)功能。越來越多的研究表明，外泌體在與許多生理和病理功能相關(guān)的各種細(xì)胞間相互作用途徑中發(fā)揮著重要作用。

間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

心血管疾病

在大鼠心肌梗死 (MI) 模型中，使用人骨髓源性 MSC (hBM-MSC) 的囊泡研究了 MSC 分泌的外泌體的心臟保護(hù)作用。據(jù)報(bào)道，心肌內(nèi)注射外泌體可改善心臟指標(biāo)，如心臟收縮和舒張性能以及血流量。MSC 外泌體還能夠通過減少小鼠的血管重塑和缺氧性肺動(dòng)脈高壓來發(fā)揮治療作用。這些結(jié)果是由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 3 (STAT3) 途徑的失活和肺細(xì)胞中 miR-204 的上調(diào)介導(dǎo)的。據(jù)報(bào)道，過表達(dá) CXCR4 (ExoCR4) 的轉(zhuǎn)基因大鼠 BM-MSC 釋放的外泌體可提高胰島素樣生長因子 1α (IGF1α) 和 pAkt 的水平，抑制 caspase 3，并促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF) 上調(diào)和腎小管生成。

此外，外泌體 miR-210 被證明可促進(jìn)血管生成并在體外和體內(nèi)保持心臟功能。為了探索子宮內(nèi)膜來源的 MSC 外泌體的心臟保護(hù)作用，外泌體介導(dǎo)的 miR-21 穿梭歸因于 PTEN 的抑制、Akt 的刺激以及 Bcl-2 和 VEGF 的上調(diào)。結(jié)果，心臟功能得到恢復(fù)，梗塞面積縮小。研究也發(fā)現(xiàn)了顯著的結(jié)果。當(dāng)心臟干細(xì)胞用 BM-MSC 外泌體預(yù)處理并施用于 MI 大鼠模型時(shí)。在這里，心臟纖維化減少，存活率和毛細(xì)血管密度顯著提高。

腎臟疾病

為了研究 BM-MSC 外泌體的腎臟保護(hù)作用，研究發(fā)現(xiàn)編碼 CDC6、CDK8 和 CCNB1 的外泌體 mRNA 以及外泌體肝細(xì)胞生長因子 (HGF) 和 IGF1 介導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)入和隨后的腎小管上皮細(xì)胞增殖，同時(shí)阻斷細(xì)胞凋亡。

使用輸尿管梗阻小鼠模型研究了 AD-MSC 外泌體過表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子 (GDNF) 的腎臟保護(hù)作用對(duì)腎損傷的影響。在這里，外泌體可以減少管周毛細(xì)血管稀疏和腎纖維化。

此外，它們刺激血管生成、細(xì)胞遷移、sirtuin 1 信號(hào)通路以及賦予細(xì)胞凋亡抗性 [62]。在缺血再灌注損傷 (IRI) 大鼠模型中，BM-MSC 外泌體給藥與改善腎小管上皮細(xì)胞增殖和存活相關(guān)，最有可能是通過外泌體 miRNA 和 mRNA 分子介導(dǎo)腎臟保護(hù)信號(hào)通路。

最近也有報(bào)道稱，從腎源性 MSC 釋放的外泌體通過攜帶編碼堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (bFGF)、IGF1 和 VEGF 的促血管生成 mRNA 分子來誘導(dǎo)腎組織中的血管生成。在腎 IRI 大鼠模型的另一項(xiàng)研究中，脂肪細(xì)胞衍生的 MSC (AD-MSC) 外泌體通過下調(diào)促炎細(xì)胞因子和 Smad3 和 TGFβ 纖維化蛋白來降低肌酐和血尿素氮 (BUN) 的水平并改善腎功能以及增強(qiáng)抗凋亡蛋白和血管生成生物標(biāo)志物。

在慶大霉素誘導(dǎo)的 AKI 模型中，BM-MSC 外泌體通過上調(diào) IL10 和下調(diào) TNFα 和 IL6 表達(dá)顯著減少炎癥。為了探索 MSC 外泌體在腎臟組織中的抗氧化作用，研究表明源自人類沃頓氏果凍 MSC (hWJ-MSCs) 的外泌體可以抑制 NADPH 氧化酶 (NOX) 和活性氧，同時(shí)觸發(fā) Nrf2/抗氧化反應(yīng)元素，從而導(dǎo)致腎功能改善和細(xì)胞凋亡抑制。

肝臟疾病

MSC 分泌的外泌體也被用于許多研究，以探索其對(duì)肝臟疾病的治療效果。在四氯化碳 (CCl4) 誘導(dǎo)的肝損傷 (LI) 小鼠模型中移植 hWJ-MSC 外泌體被證明可以通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和滅活轉(zhuǎn)化生長因子 β1 來限制肝纖維化 (LF) 并保護(hù)肝細(xì)胞。

在對(duì)乙酰氨基酚/H2O2 誘導(dǎo)的 LI 的體外模型和 CCl4 誘導(dǎo)的急性 LI 的小鼠模型中探索了從人胚胎干細(xì)胞衍生的 MSC (hESC-MSC) 中分離的外泌體的保肝作用，并發(fā)現(xiàn)這些外泌體通過上調(diào) PCNA 和細(xì)胞周期蛋白 D1 細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和抗凋亡 Bcl-xL 基因的表達(dá)，促進(jìn)組織再生。

在使用 CCl4 誘導(dǎo)的 LF 小鼠模型的另一項(xiàng)研究中，顯示由絨毛膜板衍生的 MSC 釋放的外泌體含有 miR-125b，其通過阻斷 Smo 產(chǎn)生并因此滅活 Hedgehog 信號(hào)通路而表現(xiàn)出保肝作用。

在另一項(xiàng)工作中，在小鼠急性 LI 模型中，單次施用含有谷胱甘肽過氧化物酶 1（GPX1）（一種重要的人類抗氧化劑）的 hWJ-MSC 外泌體可以通過清除過氧化氫和緩解氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡來治療該疾病 。在 D-半乳糖胺/TNFα 誘導(dǎo)的肝衰竭致死小鼠模型中，外泌體 Y-RNA-1 分子被證明可以通過調(diào)節(jié)外周炎癥反應(yīng)和觸發(fā)抗細(xì)胞凋亡作用來恢復(fù) LI 并增加存活率。

神經(jīng)系統(tǒng)疾病

據(jù)報(bào)道，從 BM-MSC 釋放的外泌體顯示出治療效果，因?yàn)樗鼈兛梢曰謴?fù)缺血后神經(jīng)損傷，增強(qiáng)血管神經(jīng)生成，并在鼠中風(fēng)模型中表現(xiàn)出長期的神經(jīng)保護(hù)功能。

當(dāng)將 BM-MSC 外泌體靜脈注射到大鼠中風(fēng)模型時(shí)，神經(jīng)血管可塑性得到促進(jìn)，紋狀體和皮質(zhì)缺血邊緣區(qū)的軸突密度和突觸素陽性區(qū)域得到改善。

對(duì) BM-MSC 外泌體的進(jìn)一步研究表明，它們含有 miR-133b，這有助于神經(jīng)突重塑和隨后的中風(fēng)在傳遞到星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元后的恢復(fù)。

此外，發(fā)現(xiàn)這些外泌體攜帶 miR-17-92 簇，其介導(dǎo)缺血邊界區(qū)域的神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)重構(gòu)和少突膠質(zhì)細(xì)胞生成。在這里，進(jìn)一步證明富含 miR-17-92 簇的外泌體具有抑制 PTEN（已證實(shí)的 miR-17-92 簇的靶基因）并因此激活下游蛋白質(zhì)蛋白激酶 B和糖原合酶激酶 3β。

在炎癥誘導(dǎo)的早產(chǎn)腦損傷的實(shí)驗(yàn)室模型中，據(jù)報(bào)道 BM-MSC 外泌體可阻止神經(jīng)變性、小膠質(zhì)細(xì)胞增生并抑制反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。

在另一項(xiàng)研究中，注射 BM-MSC 外泌體后神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥減少和腦功能恢復(fù)。在探索 BM-MSC 外泌體在創(chuàng)傷性腦損傷 (TBI) 中的神經(jīng)保護(hù)作用時(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)外泌體促進(jìn)血管生成和神經(jīng)元生長速率，同時(shí)減少 TBI 后病變邊界區(qū)和齒狀回的炎癥。

在另一項(xiàng) TBI 研究中，從骨源性 MSC (B-MSC) 中分離的外泌體通過減小病變大小和恢復(fù)神經(jīng)行為表現(xiàn)表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用。這些結(jié)果是通過抑制促凋亡 Bcl-2 相關(guān) X 蛋白、TNFα 和 IL1β 的表達(dá)、抗凋亡蛋白 B 細(xì)胞淋巴瘤 2 的上調(diào)和調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化來介導(dǎo)的。

在脊髓損傷 (SCIs) 中，靜脈內(nèi)遞送的外泌體顯示出通過靶向受傷部位的 M2 型巨噬細(xì)胞來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能。據(jù)報(bào)道，靜脈注射 BM-MSC 外泌體可降低 SCI 誘導(dǎo)的 A1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例、星形膠質(zhì)細(xì)胞中 p65 陽性細(xì)胞核的百分比以及 IL1α、IL1β 和 TNFα 的表達(dá)。

這些機(jī)制歸因于 NF-κB p65 的核易位。當(dāng)全身施用 BM-MSC 外泌體在受損的臍帶組織中顯示抗炎反應(yīng)并通過星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的解體改善運(yùn)動(dòng)活性時(shí)，也報(bào)告了類似的結(jié)果。

從缺氧預(yù)處理的 BM-MSC 中分離出的外泌體可以在阿爾茨海默病 (AD) 的 APP/PS1 小鼠模型中挽救突觸功能障礙并促進(jìn)抗炎作用。在另一項(xiàng) AD 研究中，表明 AD-MSC 分泌含有豐富腦啡肽酶的外泌體，腦組織中最常用的酶用于降解 β-淀粉樣肽。當(dāng)這些外泌體轉(zhuǎn)移到神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中時(shí)，分泌的和細(xì)胞內(nèi)β-淀粉樣肽的水平降低。

傷口愈合

hWJ-MSC（華頓氏膠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞） 分泌的外泌體通過轉(zhuǎn)移 Wnt4 和激活 β-連環(huán)蛋白促進(jìn)傷口愈合過程，從而導(dǎo)致體內(nèi)血管生成。

據(jù)報(bào)道，來自 hWJ-MSC 的外泌體 miRNA 包括 miR-21、-23a、-125b 和-145，可通過阻斷 TGFβ2/SMAD2 通路和減少膠原沉積來阻止瘢痕形成和肌成纖維細(xì)胞積累。

MSC 外泌體還能夠觸發(fā)血管生成相關(guān)生物分子的表達(dá)，并增加小鼠模型缺血肢體的微血管密度和血液灌注。用 hWJ-MSC 外泌體處理的傷口顯示出體內(nèi)快速上皮再形成以及上調(diào)膠原蛋白 I、PCNA 和 CK19 的表達(dá)。

此外，這些外泌體含有 Wnt4，有助于 β-連環(huán)蛋白核轉(zhuǎn)位和促進(jìn)皮膚細(xì)胞增殖和遷移。據(jù)報(bào)道，MSC 外泌體還可以改善皮膚傷口愈合中燒傷引起的炎癥。例如，hWJ-MSC 外泌體通過降低促炎細(xì)胞因子（如 IL1β 和 TNFα）的 mRNA 水平同時(shí)增加 IL10 水平而表現(xiàn)出抗炎作用。

在另一項(xiàng)研究中，表明 AD-MSC 外泌體富含 miR-125a，miR-125a 通過下調(diào)血管生成抑制劑 delta-like 4 (DLL4) 表達(dá)和調(diào)節(jié)內(nèi)皮尖端細(xì)胞的生成而充當(dāng)促血管生成因子。

將源自人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的間充質(zhì)干細(xì)胞 (hiPSC-MSC) 的外泌體移植到大鼠模型的傷口部位，導(dǎo)致快速上皮再形成，促進(jìn)膠原蛋白成熟，并減少疤痕大小。

此外，這些囊泡在體外以劑量依賴性方式觸發(fā)細(xì)胞增殖和遷移，并增加 I、III 型膠原蛋白和彈性蛋白的分泌 。外泌體 miR-181c 有助于抑制 TLR4 信號(hào)通路。在這里，來自 BM-MSC 的外泌體可以劑量依賴性地促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移、管形成，觸發(fā) Akt、ERK 和 STAT3 信號(hào)通路，并上調(diào) HGF、IGF1、神經(jīng)生長因子 (NGF) 和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 1 (SDF1) 表達(dá)式。

其他疾病

在肺中，從 WJ-MSC 中分離的外泌體通過調(diào)節(jié)肺巨噬細(xì)胞的表型來緩解支氣管肺發(fā)育不良、高氧相關(guān)炎癥、纖維化、肺動(dòng)脈高壓和肺血管重塑，顯示出顯著的治療效果。

在小鼠特應(yīng)性皮炎模型中，AD-MSC 外泌體可以降低嗜酸性粒細(xì)胞、IgE、CD86+ 和 CD206+ 細(xì)胞以及浸潤的肥大細(xì)胞的水平。外泌體 miR-494 通過改善血管生成和肌生成促進(jìn)肌肉再生。在多發(fā)性硬化的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型中對(duì) BM-MSC 外泌體的研究表明，它們能夠下調(diào)促炎細(xì)胞因子并誘導(dǎo) Treg。

MSC 分泌的外泌體現(xiàn)在被廣泛用于開發(fā)針對(duì)多種疾病的新型再生策略，因?yàn)樗鼈儌鬟_(dá)了 MSC 的大部分治療特性。外泌體提供了無細(xì)胞療法的可能性，從而最大限度地減少了有關(guān)施用活細(xì)胞的安全問題。在許多情況下，MSC 外泌體的再生作用歸因于它們?cè)谑荏w細(xì)胞中的抗炎功能。利用這些免疫調(diào)節(jié)作用，可以使用 MSC 衍生的外泌體來治療不同的炎癥和自身免疫疾病。外泌體的功能可以通過 MSC 培養(yǎng)的預(yù)處理輕松調(diào)整，例如通過添加化學(xué)因子或細(xì)胞因子、施加缺氧條件以及引入基因修飾（如 CRISPR/Cas9 技術(shù)）。總之，各種研究工作的結(jié)果表明，MSC 衍生的外泌體具有治療多種疾病的潛力。旨在確定治療功效和安全問題標(biāo)準(zhǔn)的努力將加速 MSC 衍生的外泌體作為再生劑的臨床實(shí)施。

References:Sepideh Nikfarjam, et al.?Mesenchymal stem cell derived-exosomes: a modern approach in translational medicine.Journal of Translational Medicine?volume?18, Article?number:?449?(2020)?