細(xì)胞外囊泡在皮膚抗衰老中的應(yīng)用

皮膚衰老是生理性、不可避免的，其具體表現(xiàn)多種多樣， 包括組織變得萎縮、脆弱，出現(xiàn)修復(fù)缺陷、免疫缺陷及易受感染。皮膚衰老受內(nèi)在及外在等多種不同因素的影響，同時在 衰老局部留下多種印記。皮膚衰老所導(dǎo)致的一系列不良后果， 使得人們對抗衰老的需求越來越強烈。

衰老過程包括生理和功能退化，這種退化在生物體的一生中不斷發(fā)展，由各種遺傳和非遺傳環(huán)境因素引起，最終， 體內(nèi)平衡被破壞，對疾病的易感性增加。臨床上，皮膚衰老表現(xiàn)為細(xì)紋和皺紋、彈性喪失、色素異常、表皮變薄和粗糙度增加。隨著年齡的增長，干細(xì)胞功能受損，不再維持表皮組織穩(wěn)態(tài)和修復(fù)受損組織，導(dǎo)致皮膚衰老。

本系列旨在科學(xué)的講述極受關(guān)注的干細(xì)胞相關(guān)抗衰老的研究進(jìn)展，其中主要描述應(yīng)用較多的間充質(zhì)干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞及其衍生物（外泌體、條件培養(yǎng)基、細(xì)胞外囊泡、細(xì)胞外基質(zhì)）在皮膚抗衰老中的研究成果及作用機制。

細(xì)胞外囊泡（Extracellular vesicles, EVs）是細(xì)胞分泌的雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)小泡，在各種細(xì)胞及組織之間起著物質(zhì)傳遞、信息溝通的作用，其各亞群主要以直徑大小區(qū)分。

外泌體（約20-200nm）是EVs中的一個亞群，包含了 蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖及RNA等物質(zhì)：蛋白質(zhì)主要包括骨架蛋 白、膜相關(guān)連蛋白、四分子交聯(lián)體家族的CD9、CD63，MHC 類分子及熱休克蛋白和脂質(zhì)相關(guān)蛋白。

脂質(zhì)主要包括神經(jīng) 酰胺，膽固醇、磷脂酰絲氨酸和鞘磷脂，多糖主要是甘露 糖。RNA主要包括了mRNA、miRNA和ncRNA等。不同的外泌體在成分上有細(xì)微的差別，體現(xiàn)了細(xì)胞對外泌體形成控制的精密。

行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會 (ISEV)?

國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會 (ISEV) 于 2014 年發(fā)布了第一個細(xì)胞外囊泡研究?(MISEV) 指南)為細(xì)胞外囊泡領(lǐng)域的協(xié)議和報告標(biāo)準(zhǔn)化提供指導(dǎo)。MISEV2014指南截至2018年底累計引用超過800次，實現(xiàn)了成為研究人員指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)。2016 年對社會成員的一項調(diào)查重申了指南的必要性，并建議定期更新指南并征求廣泛的社區(qū)意見，以適應(yīng)這一快速發(fā)展的領(lǐng)域。MISEV2018，發(fā)表在Journal of Extracellular Vesicles（JEV，最初由 Taylor & Francis 出版，現(xiàn)由 Wiley 出版）更新了命名、分離、表征和功能分析等主題，整合了 380 多名 ISEV 成員的貢獻(xiàn)。

皮膚老化

皮膚老化是由固有和外在因素（尤其是紫外線輻射）引起的，這些因素會導(dǎo)致皺紋，粗糙的質(zhì)地，松弛，毛細(xì)血管擴張和色素沉著。更重要的是，皮膚衰老會增加皮膚疾病的風(fēng)險。

衰老過程中出現(xiàn)了一些特征，包括細(xì)胞衰老。細(xì)胞衰老包括細(xì)胞周期的永久停滯，并導(dǎo)致組織的再生潛力下降。

此外，衰老細(xì)胞可以分泌 SASP（衰老相關(guān)分泌表型），包括促炎細(xì)胞因子和趨化因子或釋放 EV 以維持或破壞皮膚穩(wěn)態(tài)。以前的研究表明，衰老的人類真皮成纖維細(xì)胞 (HDF) 通過提高中性鞘磷脂酶 (nSMase) 的活性和改變?nèi)苊阁w活性，產(chǎn)生比年輕 HDF 更多的 EV，同時伴隨促凋亡蛋白的所有 miRNA 增加 > 80%。

此外，與從年輕 HDF 中獲得的 EV 相比，來自衰老 HDF 的 EV 在支持角質(zhì)形成細(xì)胞分化和屏障功能方面的效果較差。

因此， EV在抗衰老皮膚再生方面受到了極大的關(guān)注。

最近的一項研究還表明，在大規(guī)模生產(chǎn)方面，細(xì)胞工程納米囊泡 (CENV) 與傳統(tǒng) EV 相比具有多個優(yōu)勢。該研究通過將人類 iPSC 連續(xù)擠出來將 CENV 應(yīng)用于衰老的人類 HDF。結(jié)果表明，CENVs 不僅刺激了年輕和衰老 HDFs 的增殖和遷移，而且恢復(fù)了與衰老相關(guān)的基因表達(dá)變化。這涉及降低衰老 HDF 中 SA-β-Gal 的活性并抑制 p53 和 p21 的表達(dá)，這是參與細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老信號通路的關(guān)鍵因素。

總體而言，這些結(jié)果表明 iPSC-CENV可能是 iPSC-exo 治療皮膚老化的有希望的替代品。

促進(jìn)了皮膚細(xì)胞的增殖

韓國牙山生命科學(xué)研究所在 Int J Mol Sci ?. 上發(fā)表的研究指出，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞（iMSCs）是細(xì)胞治療的獨特來源。研究人員研究了iMSCs的外泌體是否能促進(jìn)人類角質(zhì)細(xì)胞（HaCaT）和人類真皮成纖維細(xì)胞（HDFs）的增殖。iPSCs是由人類沃頓凍干細(xì)胞建立的，并被允許分化成iMSCs。

從MSCs（MSC-exo）和iMSCs（iMSC-exo）的培養(yǎng)上清液中收集外泌體，并研究了它們的特征。兩種類型的外泌體都具有外泌體的基本特征，并被體外和體內(nèi)的皮膚細(xì)胞所吸收。使用iMSC-exo觀察到HaCaT增殖的明顯增加，盡管兩種外泌體都增加了HaCaT和HDFs的活力和細(xì)胞周期的進(jìn)展。

在用兩種類型的外泌體處理的細(xì)胞之間，沒有觀察到傷口劃痕的閉合和修復(fù)性基因表達(dá)的明顯差異。兩種外泌體都增強了HaCaT和HDFs中膠原蛋白的分泌；然而，只在HaCaT中觀察到纖連蛋白水平的增加，而且這種效果在iMSC-exo處理中更好。只有iMSC-exo增加了細(xì)胞外信號調(diào)控激酶（ERK）-1/2的磷酸化。結(jié)果表明，iMSC-exo通過刺激ERK1/2促進(jìn)了皮膚細(xì)胞的增殖，并強調(diào)了iMSCs生產(chǎn)外泌體的應(yīng)用。

治療皮膚老化方面具有治療潛力

韓國江原國立大學(xué)的研究人員在 Int J Mol Sci ?.上發(fā)表的研究指出，干細(xì)胞及其旁分泌因子已成為再生醫(yī)學(xué)的一種資源。許多研究表明，成人干細(xì)胞分泌的旁分泌因子，如細(xì)胞外囊泡（外泌體），對皮膚老化有好處。

然而，到目前為止，很少有報告表明使用來自人類多能干細(xì)胞的外泌體來治療皮膚老化。在這項研究中，研究人員從人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）的條件培養(yǎng)基中收集了外泌體，并研究了其對老化的人類真皮成纖維細(xì)胞（HDFs）的影響。

細(xì)胞增殖和存活率由MTT試驗確定，細(xì)胞遷移能力由劃痕傷口試驗和Transwell遷移試驗顯示。為了誘導(dǎo)光老化和自然衰老，用UVB（315納米）照射HDFs，并分別進(jìn)行30次以上的培養(yǎng)。

通過定量實時PCR（qPCR）評估某些mRNAs的表達(dá)水平。衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）的活性被評估為自然衰老的標(biāo)志物。

結(jié)果，發(fā)現(xiàn)來自人類iPSCs的外泌體（iPSCs-Exo）在正常條件下刺激了HDFs的增殖和遷移。用iPSCs-Exo預(yù)處理可抑制UVB照射引起的HDFs的損傷和基質(zhì)降解酶（MMP-1/3）的過度表達(dá)。

iPSCs-Exo還提高了光老化的HDFs中I型膠原蛋白的表達(dá)水平。此外，我們證明iPSCs-Exo明顯降低了SA-β-Gal和MMP-1/3的表達(dá)水平，并恢復(fù)了衰老的HDFs中I型膠原蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果表明iPSCs-Exo在治療皮膚老化方面具有治療潛力。

預(yù)防和治療皮膚老化

北卡羅來納州立大學(xué)的研究在ACS Nano .上發(fā)表的研究指出，人類真皮成纖維細(xì)胞（HDFs）是真皮的主要細(xì)胞群，隨著年齡的增長，它們逐漸失去了生產(chǎn)膠原蛋白和更新細(xì)胞間基質(zhì)的能力。FDA批準(zhǔn)的自體經(jīng)皮注射HDFs的一個臨床應(yīng)用旨在完善面部輪廓和延緩皮膚老化。

然而，所使用的自體HDFs的質(zhì)量因患者的狀態(tài)而異，并且由于它們在擴張過程中經(jīng)歷了許多通道。

在這項研究中，收集并比較了來自三維球狀體（3D HDF-XO）和HDFs單層培養(yǎng)（2D HDF-XO）的因子和細(xì)胞外囊泡。與二維HDF-XO相比，三維HDF-XO表達(dá)的金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）和不同表達(dá)的miRNA載體水平明顯更高。

接下來，三維HDF-XO在體外和裸鼠光老化模型中誘導(dǎo)膠原蛋白合成和抗衰老的功效被證明。一個無針注射器被用來進(jìn)行外泌體治療。三維HDF-XO引起了I型膠原蛋白表達(dá)的增加和MMP-1表達(dá)的明顯減少，主要是通過腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的下調(diào)和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）的上調(diào)。

此外，3D-HDF-XO組顯示出比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡更高的真皮膠原蛋白沉積水平。

這些結(jié)果表明，來自3D培養(yǎng)的HDF球狀體的細(xì)胞外囊泡具有抗皮膚老化的特性，有可能預(yù)防和治療皮膚老化。