JEV：單細胞的胞外囊泡異質性

與細胞外囊泡(EV)相關的不同來源、納米級和侵入性分離程序意味著它們通常被大量研究并與其親代細胞斷開關聯。近日，來自英國曼徹斯特大學的研究人員在JEV雜志上發表文章，使用超分辨率顯微鏡直接比較單個人類單核細胞衍生巨噬細胞(MDM)分泌的EVs。研究發現不同類型巨噬細胞分泌的EVs特征（大小、攜帶的蛋白）不同。超分辨率顯微鏡可以在單個細胞的基礎上對EV進行定量分類，以根據其EV分泌物定義巨噬細胞亞群。

巨噬細胞存在于全身組織中，它們在先天免疫和適應性免疫的協調中發揮關鍵作用。它們有能力對許多環境刺激做出反應，這些刺激會導致不同的激活狀態，從而實現專門的功能。雖然巨噬細胞表型高度異質，但有兩種主要的活化表型；經典激活的M1巨噬細胞和交替激活的M2巨噬細胞。此外，M0用于描述預激活的巨噬細胞。M1巨噬細胞通常是促炎細胞，而M2則表現出更再生的表型。除了M1和M2巨噬細胞外，環境因素會導致進一步的特化，例如肺泡巨噬細胞和肝臟中具有可變M1和M2表型的Kupffer細胞。

巨噬細胞在免疫反應中具有多種作用。用IgG介導的外來顆粒的檢測和吞噬作用通過Fcγ受體(FcγRs)的連接發生，該受體觸發細胞活化、吞噬作用和炎癥介質的釋放。在遇到識別過的顆粒時，巨噬細胞會在吞噬其目標之前形成吞噬突觸。除了直接吞噬病原體外，巨噬細胞還通過形成免疫突觸與適應性免疫系統的細胞相互作用，與吞噬突觸類似，這些突觸是細胞信號傳導的結構化區域。病原體衍生的抗原可以通過MHCII類蛋白在巨噬細胞-T細胞界面呈遞給T細胞受體(TCR)，從而導致T細胞活化。此外，巨噬細胞分泌細胞因子和細胞外囊泡(EV)，它們可以啟動T細胞并以多種方式調節免疫反應。抗原呈遞和細胞因子釋放是經過充分研究的方式，巨噬細胞通過這些方式調節免疫系統的激活和分化。然而，直到最近，EVs還沒有得到充分研究，并被認為是一種廢物清除機制，而不是細胞間通訊和受體細胞功能調節所必需的。

已經確定了多種EV亞型，例如外泌體、微泡和凋亡小體，這些亞型可以通過它們的起源和大小來表征。EV的作用可以是生理和病理的，取決于它們的貨物和膜組成。Tkach等人證明來自未成熟樹突狀細胞的小型和大型EV差異誘導CD4+T細胞活化，巨噬細胞衍生的EV已被證明會影響其他細胞的功能。例如，LPS誘導的肺泡巨噬細胞分泌EV可促進ICAM-1在上皮細胞上的表達。

盡管取得了很大進展，但我們對EV亞群的異質性和多樣化功能的理解仍處于起步階段。事實證明，了解EV的細微差別具有挑戰性，因為EV幾乎完全是批量研究的，這只能揭示整個EV群的平均影響。因此，這些研究提供的關于EV組成、大小和貨物的異質性及其細胞間變異性的信息有限。一種更深入地了解單個EV的方法是超分辨率顯微鏡，它已被用于識別孤立EV中胰腺癌的生物標志物，并跟蹤癌癥衍生EV的細胞間轉移。然而，盡管這些研究表明了超分辨率顯微鏡在EV研究中的潛力，但這些研究仍然將EV與產生它們的單個細胞斷開，因此無法理解單細胞分泌物的貢獻和異質性。

該研究利用超分辨率顯微鏡直接觀察和表征單個巨噬細胞分泌的EV的異質性，并揭示HLA-DR在M1樣肺巨噬細胞衍生的EV上顯著富集。定量單細胞分泌譜分析使我們能夠根據它們分泌的EV將單個巨噬細胞分為五種亞型。為由低M0和M2樣EV分泌譜非常相似，但分或非常低HLA-DR表達定義的兩種類型。從單個肺巨噬細胞釋放的EV形成兩種富含HLA-DR的類型，大約20%的M1樣巨噬細胞分泌與肺巨噬細胞匹配的EV。其他M1樣細胞表現出第五種分泌亞型。因此，超分辨率顯微鏡可以在單個細胞的基礎上對EV進行定量分類，以根據其EV分泌物定義巨噬細胞亞群。

比較單個巨噬細胞的EV譜

MDM被區分為M0、M1或M2樣，激活后所有三種分泌EV的密度相似。然而，M0樣細胞比M1和M2樣巨噬細胞分泌更大的EV。蛋白質組學分析揭示了不同大小的EV的成分以及不同MDM表型分泌的EV之間的差異。單細胞分泌物的超分辨率顯微鏡發現II類MHC蛋白HLA-DR在約40%的M1樣MDM分泌的EV上表達，這是M0樣和M2樣EV觀察到的頻率的兩倍。從癌癥患者切除的肺中分離出的人類巨噬細胞分泌的EVs表達HLA-DR的頻率是M1樣EVs的兩倍，強度更高。對所有四種巨噬細胞表型的單細胞EV譜的定量分析揭示了不同的分泌類型，其中五種在多個樣本隊列中是一致的。M1樣MDM的一個亞群分泌與肺巨噬細胞相似的EV，這表明在癌癥患者的肺部內具有特定EV分泌譜的細胞的擴增或募集。因此，EV異質性的定量分析可用于單細胞分析和揭示新的巨噬細胞生物學。

參考文獻：

DechantsreiterS, Ambrose AR, Worboys JD, Lim JME, Liu S, Shah R, Montero MA, Quinn AM,Hussell T, Tannahill GM, Davis DM. Heterogeneity in extracellular vesiclesecretion by single human macrophages revealed by super-resolution microscopy.J Extracell Vesicles. 2022 Apr;11(4):e12215. doi: 10.1002/jev2.12215. PMID:35415881; PMCID: PMC9006015.