克服皮膚的障礙：外泌體技術帶來的全新美容療法

外泌體是具有脂質雙層結構的納米級貨物，攜帶多種生物分子，包括脂質、蛋白質和核酸。

 

這些小囊泡由大多數類型的細胞分泌以相互交流。由于外泌體通過體液循環，它們不僅可以將信息傳遞給本地細胞，還可以傳遞給遠程細胞。

因此，外泌體被認為是各種治療的潛在生物標志物。最近，研究表明外泌體對皮膚老化、特應性皮炎和傷口等皮膚缺陷有療效。此外，正在研究將外泌體用作商業化皮膚治療產品的重要成分。

近期科學家Gi Hoon Yang, Yoon Bum Lee, Donggu Kang等在Biomaterials Research發表了標題為Overcome the barriers of the skin: exosome therapy的綜述，旨在闡明外泌體具有多種有益于皮膚組織再生的能力，以及外泌體在皮膚科領域的巨大應用潛力，。

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細胞外囊泡與外泌體

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在 2000 年代初期，間充質干細胞療法已成為治療各種缺陷和疾病的替代方法。間充質干細胞 (MSCs) 廣泛用于臨床試驗，不僅因為它們的多能性，而且因為它們易于從各種成人組織（如皮膚、胎盤、臍帶血、臍帶組織、脂肪組織、牙髓）中獲取、擴展和分離、睪丸和大腦。

 

最新的一些研究表明，MSCs 本身并不參與治療過程。注入缺陷部位的干細胞顯示出低細胞活力，并且細胞數量較少傾向于與宿主組織中的受體細胞融合。

相反，最近的研究表明，MSCs 的治療功效通過釋放生物分子是有益的。這些生物活性因子由細胞以被稱為細胞外囊泡 (EV) 的微米到納米級顆粒的形式分泌。

 

細胞外囊泡包含脂質、蛋白質和核酸形式的信號，這些信號可以在參與調節生理和病理活動的細胞之間交換。根據顆粒的大小，細胞外囊泡可分為外泌體（40 到 100?nm）、微泡（150 到 1000?nm）和凋亡小體（>?1000?nm。

 

此外，釋放機制不同，其中微泡直接從細胞膜釋放，而外泌體通過多泡體（MVB）和質膜的融合釋放。

 

外泌體的歷史

 

外泌體的第一次觀察早在 1960 年代，當時人們知之甚少。在 1980 年代后期獲得了更多關于外泌體的發現。在對綿羊網織紅細胞成熟的研究中，揭示了外泌體形成的機制。

 

研究表明，小囊泡在內體內部形成，然后在胞吐過程中釋放到細胞外環境中。多年后，一項研究提出，外泌體是包含 mRNA 和 microRNA (miRNA) 的小型穿梭機，可實現遠程遺傳通信。從那時起，外泌體在各種治療領域揭開了新的范式。

 

用于治療應用的外泌體

 

對于外泌體在治療應用中的使用，高提取效率和高質量外泌體的大規模生產至關重要。為了實現這一點，上游（細胞培養）和下游（分離）制造過程非常重要。

 

外泌體的大規模生產很大程度上依賴于細胞培養技術。當前的放大制造系統基于二維細胞培養方法，包括多層燒瓶工藝。各種研究表明，與基于 2D 的培養相比，基于 3D 的細胞培養導致顆粒數量增加并提高了質量。基于 3D 的細胞培養方法的一些示例包括使用 3D 支架、生物反應器和球體。

 

為了獲得高質量的外泌體，分離技術應提供高產率和高純度。不同的隔離技術，包括基于 UC、PT 和 CT 的方法。在這里，PT（ExoQuick、Total Exosome Isolation Reagent 和 Exo-PREP）和 CT (qEV) 方法已上市。

 

因此，當使用 qEV 隔離時，獲得了最小的 EV。然而，qEV 的 EV 數量最少，而 UC、Exo-PREP 和 ExoQuick 提供的 EV 數量最多。在蛋白質含量方面，Exo-PREP 提取物的含量最高。另一方面，qEV 分離導致蛋白質含量最低。該研究小組還發現，在肺上皮損傷模型中使用分離的 EV，細胞存活率是劑量依賴性的。此外，其他研究還表明，外泌體的再生作用被發現是劑量依賴性的。

 

外泌體的適用性

 

由于它們的各種益處，外泌體已廣泛用于各種治療應用。外泌體具有內在攜帶包括蛋白質、DNA 和 RNA 在內的生物分子的能力。因此，根據細胞類型，我們可以獲得具有不同治療能力的外泌體。例如，心臟祖細胞分泌的外泌體阻止心肌細胞抵抗與氧化應激相關的細胞凋亡。

 

另一項研究表明，真皮乳頭細胞衍生的外泌體促進了毛囊的發育。此外，外泌體可以作為藥物輸送系統（DDS）的貨物。外泌體具有極低的免疫原性和高血液相容性。外泌體的精確靶向是有利于在 DDS 中使用的另一個優勢。此外，它們在體液中高度穩定，容易與受體細胞融合。

 

最后，外源性藥物可以加載到外泌體中以靶向特定疾病。目前科學家已成功地將癌癥相關的 miRNA，let7c-5p 加載到人胚胎腎 293?T (HEK293T) 細胞衍生的外泌體中，用于乳腺癌治療 。由于這些原因，外泌體已顯示出治療各種疾病的潛力。

 

皮膚治療和再生

 

皮膚組織

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皮膚是人體最大的器官，充當外部和內部環境之間的保護屏障。這種感覺器官還負責調節體溫和釋放到環境中的水分。皮膚厚度取決于身體區域，例如眼睛下方、手掌、上背部等。從解剖學的角度來看，人體皮膚具有由三層組成的復雜結構：表皮、真皮和皮下組織。

 

皮膚治療的必要性

 

隨著生活的進步，皮膚的物理變化是證明機體衰老的第一個觀察結果。自古以來，人們一直致力于通過抗衰老治療來改善皮膚質量。

 

在當今，皮膚是社會生活中的重要組成部分，可以增強自尊和自我一致性。因此，醫美和化妝品行業引入了各種抗衰老治療方法。

 

皮膚老化是由外在因素（環境因素：紫外線照射、空氣污染、吸煙和營養缺乏）和內在因素（細胞和激素變化）決定的，這些因素會導致功能喪失和再生潛力。

 

尤其是，內在的皮膚老化是一個時間依賴和不可避免的過程。損害皮膚的因素之一是活性氧 (ROS) 的形成，它加速了皮膚的老化過程。

 

結果，由于角質形成細胞萎縮，表皮層變薄。這會導致水分流失，增加皮膚的干燥和粗糙度。

 

另一個因素是加速端粒磨損，縮短端粒，導致皮膚老化。端粒是保護染色體末端的蛋白質-DNA結構，避免末端DNA序列的丟失。隨著端粒隨著時間的推移而縮短，細胞變得衰老。細胞衰老引起皮膚不同層的變化，加劇皮膚老化。然而，防止端粒縮短可能會產生嚴重的后果，例如癌癥的形成。

 

此外，包括膠原蛋白和彈性蛋白在內的細胞外基質 (ECM) 成分由于基質金屬蛋白酶 (MMP) 表達增加而減少，從而導致結構完整性喪失（拉伸強度和彈性降低）。

 

相應地，真皮和表皮之間的連接減少導致皮膚變薄。因此，在老化的皮膚中觀察到皺紋的形成。所有這些因素都會逐漸改變皮膚的細胞內環境，導致皮膚形態發生變化。

 

| 老化前后的皮膚結構

 

特應性皮炎

 

特應性皮炎 (AD) 是兒童最常見的炎癥性皮膚病之一，其主要癥狀是瘙癢，可引起焦慮、抑郁或社交回避，從而影響生活質量。

 

此外，AD 會增加患其他疾病的風險，包括過敏性鼻炎或哮喘。AD的主要原因被認為是皮膚屏障功能障礙和免疫反應。

 

簡而言之，T 輔助 (Th) 淋巴細胞在 AD 中的優勢通過表達包括白細胞介素 (IL)-4 和 IL-13 在內的細胞因子引發屏障功能的破壞和免疫功能障礙。

 

具體而言，關鍵的炎性細胞因子 IL-4 和 IL-13 負責下調絲聚蛋白 (FLG) 的表達，這與表皮屏障的形成有關。這會導致過敏反應增加。

 

Th2 表達的另一種細胞因子是與瘙癢癥發展相關的 IL-31 。這種細胞因子可以與神經元上的同源受體結合，并通過 Janus 激酶 (JAK) 信號轉導和轉錄激活因子 (STAT) 通路激活瘙癢感覺神經元。抓撓會加劇過敏反應，導致 IL-17 和 IL-22 表達，它們分別被認為是 Th17 和 Th22 表皮過度增殖的主要驅動因素 。最終，該過程加劇并發展為慢性狀態，牛皮癬。到目前為止，還沒有開發出有效的 AD 治療方法。

 

傷口愈合

 

皮膚具有自我修復能力，能夠通過一系列事件來治愈傷口：（1）體內平衡，（2）炎癥，（3）增殖，和（4）組織重塑。這是一個連續過程，直到它被中斷、異常或延長，導致傷口愈合延遲或形成慢性傷口。

 

該過程始于第一階段的體內平衡，其特征是傷口部位的血管收縮和纖維蛋白凝塊形成。在此步驟中，目的是防止失血保護血管系統。之后，傷口愈合相關分子（轉化生長因子（TGF）-β、血小板衍生生長因子（PDGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）和表皮生長因子（EGF））從凝塊和周圍組織中釋放出來，吸引中性粒細胞、巨噬細胞、內皮細胞和成纖維細胞啟動炎癥反應。

 

在下一階段，包括成纖維細胞和內皮細胞在內的細胞參與膠原蛋白的合成、毛細血管生長支持和傷口部位肉芽組織的形成。最后，傷口愈合過程經歷了肉芽組織長成無血管瘢痕的重塑階段。然而，延遲或中斷傷口愈合過程會導致皮膚疤痕形成。雖然皮膚修復的潛在機制是眾所周知的，但目前還沒有明確的治療方法。

| 傷口愈合過程包括四個階段

 

目前的皮膚療法

 

通常，上述皮膚缺陷（老化、AD 和傷口愈合）的治療基于使用化學、生物和物理試劑的局部或侵入性策略。

 

當前的抗衰老策略可分為非侵入性和侵入性程序。非侵入性皮膚治療以化妝品、化學換膚和光療的形式出現。

 

為了增強對 ROS 引發的氧化應激的保護，抗氧化劑和細胞調節劑（包括生長因子和肽）被用作成分。

 

例如，被稱為維生素 A 的視黃醇已以局部血清、乳霜、油等形式廣泛用于化妝品中，因為它們對皮膚治療具有有益作用，例如抗衰老作用。

 

脂溶性視黃醇通過角質層滲透皮膚并到達皮膚真皮層。一旦它滲透到皮膚中，視黃醇負責加強表皮層并抑制參與膠原蛋白降解的金屬蛋白酶的活性。

 

廣泛使用的物理療法之一是能夠產生膠原蛋白和彈性蛋白、真皮重塑以及減少色素和紅斑的激光治療。

 

在侵入性治療中，微針在皮膚治療中引起了人們的關注，它允許藥物分子穿透皮膚。微針創造了微型通道，可跳過皮膚屏障將藥物直接輸送到皮膚中。微針療法中使用的一些化妝品成分是肽、生長因子和酸。其他侵入性程序包括注射劑和提線。與非侵入性產品相比，侵入性程序提供更有效和快速的抗衰老效果，通常持續時間很短。

 

到目前為止，還沒有完全治愈 AD 的方法。目前的非處方產品為皮膚增加水分或減少瘙癢癥狀。另一方面，大多數處方產品包括類固醇或鈣調神經磷酸酶抑制劑以提供抗炎作用。同樣，使用這些產品也無法完全治愈 AD。

 

對于理想的傷口愈合，產品應提供適當的氧氣滲透性，防止污染物和水分流失，并模仿皮膚結構。特別是，對于慢性傷口管理，需要皮膚替代物。然而，目前可用的皮膚替代品存在一些局限性，如疤痕形成、昂貴的工藝、免疫排斥、結構不足等。

 

盡管目前的皮膚治療已經顯示出一些藥妝效果，但大多數可用的皮膚治療產品都缺乏完全治愈皮膚的能力。

 

皮膚治療的重要成分：外泌體

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近年來，外泌體對各種皮膚缺陷的影響得到了廣泛的研究。外泌體的主要優點是高穩定性、非免疫排斥和對靶細胞的直接刺激。特別是，外泌體中包含的 miRNA 通過與 3′-非翻譯區結合來參與各種細胞反應的調節。因此，單一成分（外泌體）可以產生多種治療效果。

 

| 外泌體皮膚再生能力的示意圖

 

外泌體的再生能力

 

血管生成能力

 

隨著皮膚老化，會發生各種變化，例如 I 型膠原蛋白含量減少、毛細血管網絡紊亂、彈性纖維變性等。這些退行性變化可能導致皮膚組織中的血管結構減少。適當的血管化是健康皮膚的重要組成部分，它為皮膚細胞提供營養供應以維持其活動。

 

因此，可以通過增加血管數量來解決老化皮膚的一種解決方案。此外，血管化在傷口愈合中起著重要作用。各種研究顯示了外泌體的血管生成特性。在一項研究中，在人臍靜脈內皮細胞 (HUVEC) 上檢測了人脂肪來源的 MSC 分泌的外泌體對血管生成的影響。

 

該研究證明了 microRNA (miR-125a) 在外泌體中在血管生成中的潛在作用。miR-125a 的過表達通過靶向 DLL4（Notch 信號通路的配體）增強了 HUVEC 中的血管生成。

 

在另一項研究中，比較了從年輕和老年志愿者身上分離的真皮內皮細胞 。結果，在兩組中檢測到的 miR-100、miR-126 和 miR-223 在老年志愿者組中均顯著下調。在這些 microRNA 中，已知 miR-126 參與保護血管和新血管形成。

 

此外，在從人微血管內皮細胞系 (HMEC-1) 提取的外泌體中發現的 miR-214 顯示出血管生成潛力。衰老細胞可以從相鄰細胞分泌的外泌體中吸收 miR-214 以退出衰老狀態。此外，外泌體 miR-214 可以調節血管的形成。

 

膠原蛋白合成

 

如前所述，真皮層由于老化皮膚中的 I 型膠原蛋白和彈性纖維的碎裂而受損。因此，重建真皮結構可能會導致皮膚抗衰老和傷口愈合。已知 MiR-21 可促進皮膚傷口愈合中的角質形成細胞遷移和上皮再形成 。

 

另一項研究表明，miR-21 增強了傷口收縮和膠原蛋白沉積。例如，針對抗衰老目的評估了源自人類皮膚成纖維細胞球體的外泌體。在這項研究中，外泌體在 UVB 照射的裸鼠上進行了測試。外泌體處理組顯示出增強的膠原合成和減少的 MMP-1 產生。

 

具體而言，調節 MMP 抑制的 TIMP-1 和 TGF-β 上調，而 miR-196a 下調導致膠原合成增加。此外，在外泌體處理后，由于 UVB 照射而產生的深而寬的皺紋變得更淺更薄。

 

科學家研究了源自人臍帶血間充質干細胞 (UCB-MSCs) 的外泌體對皮膚年輕化的影響。在外泌體中檢測到的各種生長因子中，EGF 的濃度更高。當人類真皮成纖維細胞 (HDF) 暴露于外泌體時，膠原蛋白和彈性蛋白的產生增加。因此，UCB-MSCs 衍生的外泌體可用于重建真皮層。

 

炎癥的調節

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AD 是一種由皮膚屏障缺陷引起的炎癥性皮膚病 。外泌體可用作治療 AD 的治療成分。研究人員研究了脂肪組織來源的間充質干細胞 (ASC) 來源的外泌體對 AD 治療的影響。ASC-外泌體在小鼠 AD 模型中下調炎性細胞因子如 IL-4、IL-23、IL-31 和 TNF-α 的表達。因此，在小鼠模型中以劑量依賴性方式觀察到AD癥狀減輕。

另一項研究表明，MSC 衍生的外泌體具有平衡 Th1 和 Th2 并抑制局部炎癥反應的能力，可以緩解 AD 癥狀。由于免疫平衡是 AD 的關鍵因素，科學家研究了在銀屑病患者中高表達的 miR-210 的作用。他們在研究中報告說，miR-210 誘導 Th17 和 Th1 細胞分化，同時抑制 STAT6 和 LYN 基因表達，從而抑制 Th2 分化。這表明有助于銀屑病的免疫平衡。

 

使用外泌體進行皮膚再生的各種研究

 

已經報道了各種研究外泌體對皮膚組織再生的功效。研究人員在基于藻酸鹽的水凝膠 (Alg-EXO) 中從 ASC 中提取的加載外泌體用于皮膚治療目的。使用大鼠傷口模型觀察外泌體的可行性。將 alg-EXO 組與未處理的對照組和僅藻酸鹽組進行比較。體內結果表明，alg-EXO 組在 15 天后與其他組相比顯著改善了傷口閉合。外泌體似乎誘導膠原沉積和血管形成，從而增強傷口愈合過程。

 

在另一項研究中，開發了一種由 Pluronic F127、氧化性透明質酸 (OHA) 和聚-ε-L-賴氨酸 (EPL) 組成的可注射自愈水凝膠 (FHE)，具有 ASC 衍生的外泌體釋放能力。釋放的外泌體減少了糖尿病小鼠傷口模型中傷口的愈合時間。這是可能的，因為傷口部位的細胞增殖增強、肉芽組織形成更快、上皮再形成和膠原蛋白重塑。因此，隨著傷口愈合的改善，觀察到較少的疤痕組織。

 

此外，在一項研究中科學家制備了一種殼聚糖/絲支架，負載了牙齦 MSCs 衍生的外泌體，用于皮膚再生。盡管支架單獨在糖尿病大鼠皮膚模型中顯示出良好的傷口愈合效果，但含有外泌體的支架顯示出顯著更強的愈合能力。結果表明，外泌體增強了缺損部位的上皮再形成和 ECM 沉積/重塑。

 

另外，還有研究人員開發了一種基于明膠甲基丙烯酰 (GelMA) 水凝膠的傷口敷料，由 HUVEC 衍生的外泌體組成，并將其應用于傷口缺損大鼠模型。結果表明，外泌體通過增強上皮再形成、膠原沉積和血管生成顯著加速了傷口愈合。

 

未來展望

 

外泌體已在包括皮膚在內的各種組織再生領域顯示出其潛力。但是，仍有一些限制需要解決。首先，外泌體中 miRNA、mRNA、蛋白質和脂質的確切含量和功能仍未得到解答。弄清納米級貨物中內在包裝的天然成分非常重要。

 

我們必須能夠避免使用帶有有害或有害物質的外泌體，包括損傷相關分子模式 (DAMP)。DAMP 被稱為警報素，它從受傷的組織中釋放出來，啟動免疫系統。在不充分的情況下觸發炎癥反應可能導致自身免疫性疾病、心血管疾病和神經退行性疾病等疾病。因此，標準化、可擴展性和驗證仍然是臨床應用的障礙。

 

其次，盡管外泌體分離技術取得了進步，但尚未建立金標準。應降低分離程序的成本和復雜性，同時應提高外泌體純度。第三，對于治療應用，高質量外泌體的大規模生產應該是可能的。為提高效率，應開發具有高效隔離技術和實時定量分析技術的多功能系統。

 

第四，未來可能會使用外泌體開發個性化皮膚治療產品。根據皮膚類型、狀況和缺陷，可以選擇外泌體的數量和類型。為此，應考慮外泌體的保存方法。為了維持其中的蛋白質和 RNA，外泌體應儲存在 -?20?°C或?-?80?°C 以下。其他儲存方法是冷凍干燥技術，建議使用冷凍保護劑。然而，使用這些方法進行的長期保存仍未明確用于診斷和治療應用。最后，外泌體有朝一日可能成為醫學領域的關鍵要素。正在進行各種研究，以尋找不僅可以治愈癌癥，還可以治愈其他無法治愈的疾病，例如帕金森病、阿爾茨海默病和肌萎縮側索硬化癥 (ALS) 。使用外泌體的另一種潛在方法是疫苗開發。

 

外泌體成為再生醫學領域 MSCs 的有益替代品。這些潛在的納米載體表現出用于皮膚治療的各種治療特性。對外泌體的好奇心一直是進步和發展的驅動力。從那時起，已經發表了數千項研究，并且正在研究外泌體以實現商業化。這篇綜述討論了外泌體作為皮膚治療的潛在候選者。外泌體具有多種有益于皮膚組織再生的能力：（1）血管生成能力，（2）膠原蛋白合成，和（3）炎癥調節。使用外泌體作為成分，可以克服目前皮膚治療的局限性。此外，這些引人入勝的生物材料可以整合到癌癥治療和疫苗等各個領域。希望外泌體在不久的將來為治療各種疾病和癌癥提供一個新平臺。