細胞外囊泡分離前儲存樣品的 7 個注意事項

在細胞外囊泡存儲方面，有許多變量需要考慮。在這里，我們分享了從收集時間到處理樣品進行細胞外囊泡隔離之間要考慮的 7 個因素。

使用細胞外囊泡 (EV) 時，樣品通常需要在兩個主要階段進行儲存。首先，從采集到處理樣品，將 EV 與樣品中的其他成分分開。然后，一旦分離過程完成，樣品中純化的、含有 EV 的部分需要儲存到分析和應(yīng)用時間。

收集和存儲技術(shù)的開發(fā)對于推進細胞外囊泡研究領(lǐng)域以及開發(fā) EV 相關(guān)應(yīng)用程序至關(guān)重要。以前，科學(xué)家們在 4 個原因中介紹了這一點的重要性，為什么儲存條件對細胞外囊泡研究很重要。存儲技術(shù)開發(fā)指南可在科學(xué)家們最近的應(yīng)用說明中找到，標題為“如何存儲細胞外囊泡：各種樣品中 EV 存儲的綜合指南等”，以及大量已發(fā)布的最新資源與樣品儲存有關(guān)。

作為這個三部分系列的第二部分，我們重點介紹了在 EV 前隔離階段存儲樣本時要考慮的七個因素：

1. 采血管的選擇：對囊泡濃度的影響

最大限度地減少血小板的激活，以及隨后體外釋放血小板 EV，是處理血液樣本時要考慮的最重要因素之一。采血管的選擇是影響血小板活化的幾個關(guān)鍵變量之一，因此是一個關(guān)鍵的考慮因素。離體釋放的EV數(shù)量可能很大；例如，一項研究表明，與采集時相比，采集三小時后全血中基于數(shù)量的微泡濃度大約高出七倍；這在收集在肝素管中的樣本中得到了體現(xiàn)，樣本在 37°C 下輕輕滾動儲存。這種趨勢也在儲存在含有檸檬酸鈉或 EDTA 的管中的全血中觀察到，但程度較小。對于在相同條件下儲存的血漿樣品，當使用肝素或檸檬酸鹽試管三小時后，微泡濃度也增加，而在 EDTA 血漿中采集樣品后計數(shù)沒有增加。

2. 蛋白酶抑制劑在尿樣中的應(yīng)用

蛋白酶抑制劑可防止蛋白質(zhì)降解，包括與 EV 相關(guān)的蛋白質(zhì)。已通過蛋白質(zhì)印跡法證明了添加到尿液中的蛋白酶抑制劑對典型尿液 EV 膜相關(guān)蛋白的影響，這表明當使用蛋白酶抑制劑時，尿液 EV 制劑中存在更大的信號。應(yīng)立即添加蛋白酶抑制劑鑒于有證據(jù)表明 EV 在尿液收集后數(shù)小時內(nèi)迅速降解。

3. 去除牛奶中豐富的混雜結(jié)構(gòu)

牛奶樣品因其高脂肪和酪蛋白含量而需要特殊處理。例如，在通過離心去除細胞后，在儲存或處理上清液之前，需要小心去除上層脂肪（含有乳脂肪球）。牛奶和山羊奶需要特別注意，因為它們含有特別高水平的酪蛋白，而由此產(chǎn)生的酪蛋白膠束可能會給EV的分離帶來挑戰(zhàn)。已經(jīng)提出了幾種方法來幫助酪蛋白聚集和隨后的去除，例如添加乙酸或鹽酸。但是，在使用這些酸性處理時必須小心，因為它們會影響 EV 表面標記。

4. 如果可能，立即純化 BALF 樣品

理想情況下，EV 應(yīng)該從新鮮的支氣管肺泡灌洗液 (BALF) 樣本中分離出來，因為冷凍會導(dǎo)致聚集體的存在。

5. 唾液的特殊考慮

與大多數(shù)其他樣品相比，唾液具有很高的粘性。因此，建議在繼續(xù)處理之前用 PBS 或 Tris 緩沖鹽水稀釋。在 EV 分離或儲存之前，應(yīng)使用適當?shù)乃俣入x心，不僅可以去除受試者的細胞，還可以去除微生物細胞（需要不同的離心設(shè)置）。

6. 評估細胞培養(yǎng)中的細胞死亡

應(yīng)盡量減少體外細胞死亡，以避免樣品被來自壓力和/或死細胞的 EV 污染。這可以通過在 EV 分離前確定可接受的限度并分析細胞死亡程度來有所緩解。

7. 最后一個重要的問題：你記錄了一切嗎？

研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多可能影響EV數(shù)量和組成的變量，但仍然存在未知數(shù)。養(yǎng)成細致記錄的習(xí)慣當然是進行實驗的好習(xí)慣——隨著進一步傳播影響EV的參數(shù)，這可能會有所幫助。

References

1. Fendl B, Weiss R, Fischer M, Spittler A, Weber V. Characterization of extracellular vesicles in whole blood: Influence of pre-analytical parameters and visualization of vesicle-cell interactions using imaging flow cytometry. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2016;478(1):168-173. doi:10.1016/j.bbrc.2016.07.073
2. Zhou H, Yuen PST, Pisitkun T, et al. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney International. 2006;69(8):1471-1476. doi:10.1038/sj.ki.5000273
3. Oosthuyzen W, Sime NEL, Ivy JR, et al. Quantification of human urinary exosomes by nanoparticle tracking analysis. The Journal of Physiology. 2013;591(23):5833-5842. doi:10.1113/jphysiol.2013.264069
4. Rahman MdM, Shimizu K, Yamauchi M, et al. Acidification effects on isolation of extracellular vesicles from bovine milk. Fan G-C, ed. PLOS ONE. 2019;14(9):e0222613. doi:10.1371/journal.pone.0222613
5. Carnino JM, Lee H, Jin Y. Isolation and characterization of extracellular vesicles from Broncho-alveolar lavage fluid: a review and comparison of different methods. Respiratory Research. 2019;20(1). doi:10.1186/s12931-019-1210-z
6. Ogawa Y, Taketomi Y, Murakami M, Tsujimoto M, Yanoshita R. Small RNA transcriptomes of two types of exosomes in human whole saliva determined by next generation sequencing. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 2013;36(1):66-75. doi:10.1248/bpb.b12-00607
7. Witwer KW, Buzás EI, Bemis LT, et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2013;2(1):20360. doi:10.3402/jev.v2i0.20360
8. Théry C, Witwer KW, Aikawa E, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 2018;7(1):1535750. doi:10.1080/20013078.2018.1535750