Axicabtagene ciloleucel(簡稱Axi-cel)和Tisagenlecleucel(簡稱Tisa-cel)是美國食品藥品監督管理局(FDA)最早批準的兩種用于侵襲性大B細胞淋巴瘤(LBCL)的CAR-T細胞產品。雖然這兩種產品CAR設計類似，都具有相同的胞外結合域，但它們有不同的制造過程和共刺激域(分別為CD28和4-1BB)，賦予了它們不同的擴增和表型特征。
最近一項對LBCL患者的細胞輸注產品(IP)的單細胞RNA測序(scRNA-seq)數據的研究發現，良好的臨床治療效果和更多CD8 T細胞之間存在關聯，而不佳的臨床反應與CD8 T細胞的衰竭相關。但是，不同CAR-T細胞亞型進入人體后的臨床反應、具體分子機制，以及對宿主免疫系統的影響，仍不甚清晰。
2022年9月，來自美國哈佛大學的Catherine J. Wu, Gad Getz和 Marcela V. Maus研究組在《Nature Medicine》雜志上發表題為“Distinct cellular dynamics associated with response to CAR-T therapy for refractory B cell lymphoma”的文章，收集了32位給予Axi-cel(n=19)或Tisa-cel(n=13)治療的大B細胞淋巴瘤患者的105個樣本，并進行單細胞測序。研究發現，兩種藥物治療后，患者體內的細胞動力學反應存在顯著差異：Tisa-cel的療效與來自輸注產品中的少量CD8+中央記憶樣細胞的顯著擴增有關，而Axi-cel治療后T細胞譜系在輸注產品和治療后的變化較少。同時，回輸產品中CAR-T調節細胞亞群(CAR-Treg)水平的高低，與CAR-T的療效直接相關。缺乏臨床療效患者的Axi-cel產品中，CAR-Treg的頻率較高。作者進一步通過體外和體內建模表明，兩種CAR-T產品中的CAR-Treg細胞可以抑制CAR-T細胞的活性，從而促進復發。
▲圖1.用Axi-cel或Tisa-cel治療的研究設計圖示
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為了從分子水平上觀察CAR-T細胞和未轉導T細胞之間的差異，科研人員首先采用了“pseudobulk”的差異表達方法，分別計算了每個樣本的輸注產品和D7之間的差異表達基因。結果表明，第7天時兩種產品的CAR-T細胞中有463個基因被上調，包括與細胞增殖相關的基因(DIAPH3，BUB1B和KIF23)，以及T細胞激活基因(CD109)。在產品特異性分析中還發現額外的基因表達，如CTLA4在Axi-cel產品中的表達增加(圖2b)。
▲圖2.檢測每個產品的輸注產品和D7 PBMCs中CAR+和CAR-(不分離CD4和CD8)“pseudobulk”樣本之間的差異表達(左，Tisa-cel和Axi-ceI分別為n=13和n=18)。
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一些只在一個產品中發現上調的基因，反映了Axi-cel和Tisa-cel中CD28和4-1BB已知的信號差異。與CD28信號通路相關的快速激活一致，CD8+Axi-cel細胞中激活標志物PDCD1，以及檢查點調節蛋白SLAMF6的上調更強，可能提示了這個快速擴增產品的早期衰竭特征。我們還觀察到Axi-cel的輸注產品中SOS1的上調與CAR的增殖有關。
作者同時鑒別了1442個在兩個產品之間共有的，但差異化表達的基因(D7樣本中708個上調，734個下調至少兩倍)。例如，在介導干擾素殺傷細胞中發揮重要作用的ZBP1發生上調，提示在此時間點，這兩種產品的CAR-T細胞殺傷毒性增強。同時，在D7時表達降低的基因，包括與預防CAR-T細胞耗竭有關的IRF4，還有編碼關鍵T細胞免疫檢查點的CISH。
▲圖2.CD8 CAR-T細胞中輸注產品與第7天之間基因表達的變化。
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科研人員隨后評估了CD4+和CD8+亞群的相對比例是否與療效相關。結果發現，在使用Tisa-cel治療的患者中，但不是axi-cel，患者的療效與D7 CAR+細胞主要是CD8+亞型(>50%)的程度相關(圖3a)。有5/7例患者在D7時CD8+CAR+T細胞比例較低(疾病進展，其余2/7例在治療后6個月復發；相比之下，僅有1/6例CD8+CAR+T細胞大于50%的患者，表現出疾病進展。
兩個產品中這些CD8+組分從輸注產品到D7，隨時間變化有顯著差異。在Axi-cel中，D7 CAR+T細胞的CD8+的比例在不同患者中是可變的，該值與輸注產品中CD8+細胞的百分比高度相關(圖3c)；而Tisa-cel的輸注產品普遍由低于10%的CD8+細胞組成，但這些CD8+細胞在D7時顯著擴增，特別是在有長期療效的患者中(圖3c)。?
▲圖3.在使用不同產品后有療效反應患者和無療效反應患者的T細胞進化進程。a，根據患者在D7 CD8 CAR-T細胞是否大于所有CAR-T細胞的50%分層的Kaplan-Meier反應曲線。C，根據不同療效反應，CD4/CD8 T細胞在基線、治療前和治療后的外周細胞比例。
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使用常見的T細胞亞群標記物，可以將細胞分類為初始細胞(CCR7+CD45RA+)，中央記憶細胞(CM, CCR7+CD45RO+)，效應記憶細胞(EM, CCR7–CD45RO+)，重新表達CD45RA的終末分化效應記憶細胞(EMRA，CCR7–CD45RA+)和調節性T細胞(FOXP3+)。分析發現，Tisa-cel的輸注產品主要由CM和EM表型的CD4+細胞混合組成，與應答患者相比，無應答患者的CMs略有升高(圖3f)。在D7，兩種產品的CMs主要被EMs取代，不管有無療效反應。
進一步按照治療藥物和臨床結果，對輸注產品和D7 CAR-T細胞進行了聚類分析，結果發現，有療效患者和無療效患者的Tisa-cel輸注產品中，CD8+細胞的集群分布存在較大變化。Tisa-cel應答患者有更多表達CM標記CCR7和LEF1的細胞，并表達轉錄因子STAT1；無應答患者在EM1簇中的細胞數量更高，其標記物與我們在“pseudobulk”分析中觀察到的相似：干擾素(IFNG)、穿孔素(PRF1)和激活/衰竭標記物LAG3和TIM-3(圖4c)。
▲圖4.通過TCR測序追蹤CAR-T克隆的時間演化。c，通過t檢驗確定，每個組CD8+輸注產品亞簇中前10個差異表達基因。e，通過雙尾t檢驗確定，每個各組D7 CD8+亞簇中的Top差異表達基因。
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最后，作者確定了存在于輸注產品中CAR-Treg細胞的特定作用。作為一種罕見的CD4+循環淋巴細胞亞群，其在預防自身免疫中發揮著關鍵作用，但在多種腫瘤類型(包括淋巴瘤)中，也會促進免疫抑制的腫瘤微環境。不過，CAR-Treg細胞在CAR-T細胞治療后的臨床復發中是否發揮作用尚未有報道。
通過分析Tisa-cel和Axi-cel的輸注產品，并對產品間的差異進行批量校正，發現Tisa-cel中CAR-Treg細胞明顯少于Axi-cel，并且在Axi-cel輸注產品中，CAR-Treg細胞在無應答患者中出現的比率增加(圖5a)，這不是由于基線患者中預先存在的差異造成的。其他研究中心Axi-cel輸注產品的單細胞數據集，也顯示相似結果，無反應患者的Treg細胞比率有升高的趨勢(圖5b)，CAR-Treg最高占所有CAR+細胞的26.7%(范圍為3.7-26.7%)。
▲圖5.a,b CAR-Treg在輸注產品中的數據。按療效反應分組，本研究中Axi-cel和Tisa-cel輸注產品中CAR-reg細胞的比例(a)和其他研究中心Axi-cel輸注產品中CAR-reg細胞的比例(b)
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為了評估侵襲性淋巴瘤產生的耐藥性，是否與輸注產品中CAR-Treg細胞的比例高低有關，作者進行了體外和體內建模。從健康供體的外周血中分離出了大量的CD3+常規T細胞(Tconv)、Treg細胞和CD4+T細胞，并用靶向CD19的二代CAR轉導這些細胞群體。在體外和體內實驗中證明，與CAR-CD4對照組相比，25%的CAR-Treg細胞顯著減少了CAR-Tconv的擴增，且足以導致腫瘤復發。
緊接著作者在體內進一步降低CAR-Treg的比例，使其更符合生理狀態，將由95% CAR-Tconv和5% CAR-CD4或5% CAR-Treg細胞組成的CAR-T細胞，注射NSG荷瘤小鼠。第3天所有小鼠的早期腫瘤明顯地被清除，但延長觀察期后，所有CAR-Treg小鼠出現明顯復發，而對照組小鼠沒有復發(圖5e-h)。因此，CAR-Treg細胞僅占總輸注CAR-T細胞的5%，就足以驅動腫瘤復發并抑制CAR-Tconv擴增。
▲圖5.e–g，CAR-Treg細胞介導小鼠復發和體內驗證實驗。
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一名接受Tisa-cel的患者在治療6個月后CD19+復發，該患者隨后接受了相同輸注產品的二次回輸治療，并達到臨床和影像學完全緩解。對二次回輸后7天收集的PBMCs以及輸注產品采用scRNA-seq進行分析，發現兩次CAR-T細胞回輸后D7時，CAR-T細胞表現出顯著的差異。在首次輸注7天后，很少(5%)CD8+CAR-T細胞被檢測到，但在第二次輸注后觀察到約30%(增加了6倍)(圖6d)。
▲圖6. 復發及隨后二次回輸患者細胞擴增的差異。d，通過scRNA和流式細胞術發現的不同T細胞亞群中CD8+細胞的比例。e，流式細胞術檢測第7天CAR-T細胞中CD8+細胞組分。
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綜上所述，科研人員分析了使用兩種CD19 CAR-T產品治療難治性LBLC的過程中免疫細胞的轉錄組進化特征。希望通過闡明每種治療方法臨床反應的相關分子特征，幫助優化CAR-T治療方法的設計，使患者與最有可能誘導臨床反應的治療方法相匹配，并了解對抗疾病復發的策略。
參考文獻：
[1] Haradhvala, N.J., Leick, M.B., Maurer, K. et al. Distinct cellular dynamics associated with response to CAR-T therapy for refractory B cell lymphoma. Nat Med (2022). https://doi.org/10.1038/s41591-022-01959-0
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