2012年，美國費城兒童醫院細胞免疫療法的先驅—Stephan Grupp博士首次探索CAR-T（Chimeric antigen receptor T-cell）治療兒科癌癥，并成功用CAR-T療法治愈已無其他治療手段的急性淋巴細胞白血病患者Emily Whitehead。10年過去了，Emily的白血病已痊愈（圖1），Grupp表示終于可以使用“治愈”這個詞來表述CAR-T的療效。
圖1 Emily Whitehead（圖源：生物探索編輯團隊）
Grupp（圖2）表示：“我不僅僅是一名醫生，我還是一名科學家。一個病例不具有說服力，現在我們已經對數百名患者進行了CAR-T細胞療法，而且我們在這方面是獨一無二的。有幾十名患者已經正常生活5-9年或更長時間，不再需要進一步治療。我們希望CAR-T能夠惠及更多患者?！?/span>
圖2 Stephan Grupp醫生（圖源：費城兒童醫院官網）
CAR-T細胞療法原理為：將從患者血液中收集的T細胞在體外擴增，并進行工程改造以表達腫瘤抗原特異性CARs，從而使生成的CAR-T細胞能夠識別和攻擊腫瘤細胞（圖3）。CAR-T細胞療法已顯示出持久的治療效果，并有望治愈淋巴惡性腫瘤。但是，這一突破性抗癌策略的廣泛應用受到多個因素的阻礙。
圖3 CAR-T細胞療法的工作流程（圖源：費城兒童醫院）
迄今為止，CAR-T治療的患者都是用他們自己的供體，而那些接受過大量治療的患者有時缺乏足夠數量的可用于自體的功能性T細胞；再者，自體T細胞的擴增和工程化需要等待，但是一些病情嚴重的患者沒有足夠的時間；此外，CAR-T價格昂貴，國內上市的兩款CAR-T療法價格均在百萬以上（藥明巨諾129萬/支，復星凱特120萬/支）；最后，CAR-T細胞在體內復制能力差，持久性弱。因此，這種高效但繁瑣、勞動密集且昂貴的療法仍然不能廣泛使用。如果CAR-T療法要惠及普通病患，那么需要另一種更容易獲得的CAR-T細胞來源。
人類誘導多能干細胞（iPSC）是用于細胞治療的可擴展制造的理想CAR-T細胞來源。iPSC細胞具有無限增殖能力，可以分化成身體所有特化的細胞類型，可以制造臨床規模數量的具有所需抗原特異性的T細胞。iPSC可以進行基因改造，使其具有增強的特異性和效應功能，在體外產生大量分化程度較低的腫瘤抗原特異性T細胞，實現體內回輸后的高持久性。因此，將人類腫瘤抗原特異性T細胞重新編程為iPSC，然后再分化為T細胞系具有產生恢復性腫瘤抗原特異性T細胞的潛力。哈佛醫學院：利用IPSC規?；aCAR-T，可治愈更多患者先前的研究已經表明使用人類iPSC生成T細胞用于過繼性T細胞治療的可能性，但是iPSC-CAR-T細胞發育成熟度低。最近的研究表明當使用從攜帶高效重排T細胞受體（TCR）或結合類器官或胸腺培養系統的T細胞來源產生的IPSCs時，T細胞成熟度增強。因此，為了實現廣泛的基于iPSC的過繼性T細胞療法，需要能夠高效無基質產生功能齊全、發育成熟的iPSC-T細胞的方法。
2022年8月4日，哈佛醫學院和波士頓兒童醫院研究團隊在Cell Stem Cell發表題為“EZH1 repression generates mature iPSC-derived CAR T cells with enhanced antitumor activity”的研究成果（圖4）[1]。研究結果表明通過組蛋白甲基轉移酶（EZH1）抑制的表觀遺傳重塑，可使人類誘導多能干細胞（iPSC）高效生產發育成熟的T細胞，用于過繼性細胞免疫治療。
表觀遺傳調節因子在最終造血和淋巴細胞發育過程中起關鍵作用。組蛋白甲基轉移酶（EZH1）是多梳抑制復合物2（PRC2）的組成部分，是胚胎造血發育過程中淋巴組織形成的關鍵負調節因子。在此項研究中，研究人員假設敲除EZH1基因會誘導iPSC在體外分化成發育成熟的T細胞。為此，研究人員對iPSC細胞進行重編程，敲除了EZH1基因，并在無基質無血清系統中衍生出iPSC-T細胞（EZ-T細胞）；隨后，EZ-T細胞表達anti-CD19，并被注射入患B細胞淋巴瘤的小鼠體內，以評估EZ-T細胞的持久性和腫瘤清除效率（圖5）。
?IPSCs可在無血清、無基質的系統內高效分化為表達不同TCRs的T細胞
研究人員首先將人紅細胞來源的IPSCs（細胞系1157）誘導形成類胚體，以產生具有造血潛力的血源性內皮（HE）細胞；收集CD34+?HE細胞，單層種植在涂有Notch Delta樣配體4（DLL4）和VCAM-1的組織培養皿上；在SFEMII培養液中加入多種細胞因子（SCF、Flt3、IL-7、IL-3、TPO）培養HE細胞，以啟動T細胞分化；在此期間，HE細胞經歷了內皮向造血細胞的轉變（EHT），產生了含有CD5+CD7+?T細胞前體（Prots）的浮動細胞；在第14天，收集漂浮的造血細胞，在新的DLL4包被的平板上復制，然后用Flt3和IL-7培養3周；Prot細胞繼續擴張并經歷短暫的CD3+?CD4+未成熟的CD4單陽性（Isp）階段，然后激活CD8的表達形成CD4+CD8+雙陽性（Dp）細胞（圖6）。
分化5周后，檢測到CD3+?TCRαβ+T細胞。在抗CD3/CD28抗體和IL15存在的情況下進一步培養這些細胞，有助于誘導出單一陽性（SP）細胞。在第6周，大多數細胞表達CD3，其群體由DP和CD4/CD8 SP T細胞組成。無基質方案導致CD3+?T細胞產量顯著增加。與OP9-DL1共培養相比，無基質系統還導致了更有效的T細胞特異性分化，表現為T細胞比例的增加和非淋巴樣細胞頻率的降低。
為了確定無基質分化是否伴隨著正常的TCR重排，研究人員從無基質的IPSC-T細胞中提取基因組DNA，并對TCRb基因的互補決定區3(CDR3)進行測序以描述TCR譜系。免疫序列分析在VB家族基因的使用上發現了數以萬計的具有高度多樣性的獨特重排，證明了CDR3在IPSC-T細胞中的隨機重組。綜上所述，研究人員通過建立一個無間質系統，促進正常T細胞的發育，以產生具有高度多樣化的TCR譜系的IPSC-T細胞。為了確定抑制EZH1是否會促進IPSC在體外向T細胞分化，研究人員在IPSC來源的CD34+?HE細胞的T細胞分化過程中進行了shRNA介導的EZH1基因敲除。然后，通過無基質系統誘導EZH1基因敲除的HE細胞分化為EZ-T細胞，并與如上獲得的對照IPSC-SF-T細胞進行比較。EZH1基因敲除使分化2周后活細胞增加2倍，6周后CD45+造血細胞中T細胞比例增加，每個起始CD34+細胞產生的T細胞絕對數增加，提示T細胞分化的特異性和效率提高。在來自不同供者的不同重編程策略的多個IPSC系中也獲得了類似的結果，表明EHZ1基因敲除介導的T細胞分化的促進不受細胞系的限制（圖7）。
圖7 EZH1敲低促進iPSC的體外T細胞分化（圖源：[1]）
作為shRNA介導的EZH1基因敲除的替代方案，研究人員將多西環素誘導的CRISPR干擾（CRISPRi）構建到IPSC來源的CD34+?HE細胞中，以轉錄抑制EZH1的表達。在T細胞規范期間（0-2周），CRISPR介導的EZH1基因敲除導致CD3+?T細胞的產生顯著增加，而在Prot細胞形成后（2-5周）誘導EZH1-CRISPRi未能促進T細胞分化。在對照細胞中，EZH1的表達在HE進入Prot細胞期間顯著增加，并在Prot階段后下調。EZH2是EZH1的同源物，同樣作為PRC2復合體的催化亞單位，在對照和EZH1 shRNA處理的細胞中，在T細胞分化的后期都高度表達。這一觀察結果與先前的發現一致，即EZH1而不是EZH2在HE細胞中發揮抑制淋巴系承諾的功能，并解釋了為什么抑制EZH1對T細胞分化的后期階段沒有影響。分化6周后，對照組IPSC-SFT細胞含有相當比例的DP T細胞，而EZ-T細胞主要由CD8或CD4SP細胞組成。
EZ-T細胞分化后CD3+TCRαβ+顯著增加，CD3+TCRγδ+T細胞顯著減少，表明EZH1基因敲除促進了向αβ T細胞的分化，而不是γδ T細胞。EZH1基因敲除也導致CD1a減少，CD1a在胸腺細胞中表達，但不表達在成熟的外周血T細胞中，進一步表明EZ-T細胞表現出更成熟的T細胞表型。無基質分化方案支持CD8αβ T細胞的產生，EZH1基因敲除促進了CD8αβ T細胞的更高產量，幾乎檢測不到先天類似CD8αα T細胞的數量?？傊?，這些分析表明，抑制EZH1促進了IPSC細胞在體外有效地分化為成熟的SP T細胞。EZ-T細胞表現出與外周血TCRαβ T細胞相似的分子特征CellNet對RNA-seq基因表達譜的分析表明，IPSC來源的T細胞與從外周血單個核細胞（PBMC）分離的供體來源的T細胞具有高度的相似性，并與分化較低的多能HSPC有明顯的區別；檢測T細胞特征基因的表達，發現通過無基質方法分化的沒有EZH1基因敲除的IPSC-T細胞（PSC-SF-T）比通過OP9-DL1基質分化的IPSC-T細胞與CB-HSPC來源的T細胞更相似；對所有細胞類型的這些基因的表達水平進行了測定，結果再次表明EZ-T細胞表現出與αβT細胞最相似的基因表達譜（圖8）。
圖8 EZ-T細胞顯示成熟TCRab T細胞的分子特征（圖源：[1]）
為了探討EZ-T細胞成熟表型的分子機制，對EZ-T細胞中最顯著上調的基因進行了基因集濃縮分析（GSEA），并觀察到這些基因與T細胞分化或功能直接相關的過程在生物學上高度豐富。在對照IPSC-SFαβT細胞和EZH1基因敲除的細胞之間有相對少量的基因差異表達。具有EZH1基因敲除的TCRαβ T細胞更豐富地表達TRAC、TRBC2、CD2和CD7，并顯示出更大程度的下調殘基（TRDC、KLRB1）?？偟膩碚f，在體外IPSC分化過程中抑制EZH1促進了表現出更成熟表型的αβT細胞的產生。在IPSC分化過程中，EZH1基因敲除促進了T細胞的成熟，由此產生的EZ-T細胞表現出與外周血TCRαβ T細胞最相似的分子特征。iPSC衍生的EZ-T細胞重現了原始T細胞的分化，產生了表現出記憶樣表型的效應細胞和T細胞亞群。CAR EZ-T細胞在體外和體內顯示出增強的抗腫瘤活性當用抗CD19 CARs進行工程設計時，EZ-T細胞在體外和體內均比缺乏EZH1敲除的對照iPSC-SF-T細胞產生更好的抗腫瘤效果（圖9）。
圖9 CD19 CAR EZ-T細胞介導更強大的體內腫瘤清除（圖源：[1]）
iPSC細胞衍生的T細胞被進一步轉化為CAR-T細胞時，其所顯示出的抗腫瘤活性與目前用于臨床療法的方法所產生的CAR-T細胞的抗腫瘤活性相當，當與此前iPSC細胞方法所制造的T細胞相比，這些新細胞在實驗室中殺滅癌細胞和清除活體小鼠癌細胞的能力都有所增強。
研究作者Daley表示：“經過多年的研究，如今我們發現iPSC細胞最終或能幫助開發用于治療諸如癌癥等多種人類疾病的新型療法。通用型的iPSC細胞不僅能被有效轉化為CAR-T細胞，而且還能有效制造出一種增強型的CAR-T細胞，其能更加類似于目前使用的金標準臨床級的細胞，這種新型策略或許就能實現現成的CAR-T細胞療法且幫助更多患者及時有效地進行治療。雖然iPS細胞在理論上是不同細胞類型的無限來源，但研究人員必須克服衍生出成熟且功能齊全的T細胞所遭遇的挑戰，這些細胞就能幫助制造出CAR-T細胞；過去，由于iPS細胞在培養皿中更容易產生不成熟的細胞，因此研究人員一直在努力解決這個問題。”
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