原文標(biāo)題Enhancement of therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles，作者Kyong-Su Park等來自瑞典哥德堡大學(xué)薩爾格倫斯卡醫(yī)學(xué)院研究所Krefting研究中心。

在對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs) 在細(xì)胞治療中的應(yīng)用進(jìn)行臨床研究之后，人們對(duì)其分泌的可溶性因子的興趣日益增加。隨著對(duì) MSCs 及其分泌因子的研究，MSCs 釋放的細(xì)胞外囊泡 (EVs) 已成為一種新的細(xì)胞間通訊工具和串?dāng)_模式。

MSC 衍生的 EV 已被確定為在生理和病理?xiàng)l件下必不可少的信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)，它們似乎對(duì) MSC 的許多治療效果負(fù)責(zé)。在幾個(gè)體外和體內(nèi)模型中，已觀察到 EV 在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)方面具有支持性功能，主要由 EV 相關(guān)蛋白和核酸介導(dǎo)。此外，已證明用生物物理或生化信號(hào)（包括來自其他細(xì)胞的 EV）刺激 MSC 會(huì)影響后續(xù) MSC 衍生的 EV 的內(nèi)容和生物活性。

該綜述概述了 MSC 衍生的 EV 的內(nèi)容及其支持作用，并就操縱 MSC 以改善 EV 的分泌和隨后的 EV 介導(dǎo)的活動(dòng)提供了不同的觀點(diǎn)。在這篇綜述中，研究人員討論了制備MSCs 進(jìn)行基于 EV 的細(xì)胞治療以及使用 EV 影響 MSCs 中的元素表達(dá)的可能性。

通過這種方式，人們對(duì) EV 在以 MSC 為重點(diǎn)的細(xì)胞治療中的最新進(jìn)展提供了清晰的視角，并提出了相關(guān)的問題和建議，以填補(bǔ)知識(shí)空白。

細(xì)胞外囊泡 (EVs) 與外泌體（Exosomes）

細(xì)胞外囊泡 (EVs) 是由細(xì)胞釋放的強(qiáng)大生物實(shí)體，其中包含可以促進(jìn)其靶點(diǎn)變化的分子。因此，EV 已被研究用于臨床應(yīng)用，如疫苗、免疫抑制劑或修復(fù)和分化過程的刺激劑。

EV 是一個(gè)總稱，包括各種不同的釋放囊泡，例如外泌體和微泡 (MV)?！巴饷隗w”通常用于描述源自內(nèi)體起源的多泡體與質(zhì)膜融合的囊泡。這種生物發(fā)生將它們與其他 EV 區(qū)分開來，例如，通過質(zhì)膜出芽釋放的那些，通常稱為 MV。由于它們獨(dú)特的生物發(fā)生機(jī)制，MV 通常比外泌體大（通常，外泌體的直徑小于 200 納米，而 MV 的尺寸范圍可達(dá) 1000 納米），但這些尺寸范圍可能會(huì)重疊。

EV不同的分離方案?jìng)?cè)重于分離富含外泌體、MV 或兩者的組分。由于細(xì)胞外囊泡的研究是一個(gè)全新的領(lǐng)域，許多研究在報(bào)告細(xì)胞外囊泡的數(shù)據(jù)時(shí)使用了異構(gòu)命名法。通常會(huì)找到諸如“外泌體”、“MV”和“微?！敝惖男g(shù)語，指的是模糊的 EV。為了統(tǒng)一起見，研究人員在這里將所有這些研究都包括在“細(xì)胞外囊泡”一詞下。

盡管許多功能都?xì)w因于EV，尤其是參與細(xì)胞通訊，但它們?cè)隗w內(nèi)的作用仍然知之甚少。可能仍有一些主要功能和作用仍然未知，不同細(xì)胞在病理狀態(tài)下釋放的 EVs 的免疫學(xué)作用仍缺乏研究。

另一方面，由于已知分子對(duì)這些囊泡的分類和 EV 釋放的模式反映了它們的起源細(xì)胞類型和生理狀態(tài)，因此細(xì)胞外液的 EV 分?jǐn)?shù)可以提供非常豐富的信息。因此，大量注意力集中在使用含有來自受傷組織和腫瘤的 EV 的“液體活檢”來檢測(cè)疾病生物標(biāo)志物，以期開發(fā)具有高靈敏度和特異性的侵入性較小的診斷程序。將分子分類到 EV 中仍然是一個(gè)有點(diǎn)模糊的過程，但它顯然涉及不同蛋白質(zhì)和核酸的富集。作為改變靶細(xì)胞中基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的試劑，EV 的蛋白質(zhì)和 RNA 含量受到了特別關(guān)注 。

目前，對(duì)干細(xì)胞分泌囊泡的關(guān)注最廣泛地涉及間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），也稱為間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。這些細(xì)胞是多能細(xì)胞，可以從各種成人組織中分離出來。研究最多的 MSCs 是從骨髓 (BM-MSCs)、脂肪組織 (AD-MSCs) 或臍帶?(UC-MSCs) 中分離出來的。分離的 MSC 通常是異質(zhì)的，含有干細(xì)胞、定向祖細(xì)胞和分化細(xì)胞。

盡管沒有針對(duì) MSCs 的特異性標(biāo)志物，但它們通常具有在體外化學(xué)誘導(dǎo)后分化成至少三種中胚層細(xì)胞譜系（成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞）的能力 以及不存在造血譜系標(biāo)記，但存在表面相關(guān)標(biāo)記，如 CD44 和 CD90。

間充質(zhì)干細(xì)胞通過培育和促進(jìn)周圍細(xì)胞的增殖和分化來支持它們?cè)隗w內(nèi)的生態(tài)環(huán)境。當(dāng)移植用于細(xì)胞治療時(shí)，這些細(xì)胞會(huì)遷移到炎癥和損傷部位，并且以其在各種疾病模型中促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)的能力而聞名。然而，在沒有支架的情況下，它們通常不會(huì)永久植入受傷組織，因此它們只會(huì)影響目標(biāo)組織。

MSCs 及其囊泡的分泌組特別令人感興趣，因?yàn)檫@些細(xì)胞主要用于細(xì)胞治療，因?yàn)樗鼈兙哂信苑置?內(nèi)分泌作用，而不是它們的分化潛能。除了這些細(xì)胞分泌物中存在的可溶性因子（如生長因子和細(xì)胞因子）外，MSC 培養(yǎng)物的上清液還富含 EV。許多臨床前數(shù)據(jù)的例子表明，源自 MSCs 的 EVs 繼承了其原始細(xì)胞的治療效果，使用 EVs 代替細(xì)胞本身可以具有以下優(yōu)勢(shì)：

• 繞過與細(xì)胞療法有關(guān)的大多數(shù)安全問題，例如致癌細(xì)胞的細(xì)胞污染和不受控制的細(xì)胞分裂；

• 能夠?qū)@些納米顆粒進(jìn)行廣泛的潛在操作，以改善遞送和應(yīng)用效果；

• 促進(jìn)開發(fā)優(yōu)化 MSC 使用的方法，以獲得更高產(chǎn)量和更佳的治療產(chǎn)品。

間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)環(huán)境變化也非常敏感，在體外不同刺激下表現(xiàn)出不同的分泌譜系和表型，這可能與它們?cè)隗w內(nèi)對(duì)不同炎癥或損傷環(huán)境的反應(yīng)具有很大的動(dòng)力學(xué)有關(guān)。

用源自其他細(xì)胞（如肥大細(xì)胞和上皮細(xì)胞）的 EV 處理 MSC 會(huì)影響它們的表型，用可溶性因子處理和細(xì)胞培養(yǎng)條件的變化也會(huì)影響它們的表型。對(duì)于科學(xué)界來說，更好地控制 MSCs 的免疫調(diào)節(jié)和分化能力，以設(shè)計(jì)更有效和更具體的治療策略，無論是直接細(xì)胞治療還是 EV 介導(dǎo)的治療，這將是非常有趣的。

MSC 衍生的 EV 已成為各種動(dòng)物模型中免疫調(diào)節(jié)和再生效應(yīng)的有吸引力的介質(zhì)?；?EV 的方法已被認(rèn)為是一種安全且有吸引力的治療干預(yù)措施，但一個(gè)顯著的限制是 EV 的產(chǎn)量通常較低。

為了克服這個(gè)問題，一些高通量自動(dòng)化程序已應(yīng)用于大規(guī)模細(xì)胞和細(xì)胞外囊泡生產(chǎn)。最近的研究利用由脂肪干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞通過連續(xù)擠壓產(chǎn)生的模擬 EV 納米囊泡，以克服自然產(chǎn)生的 EV 低產(chǎn)量問題。此外，在許多先前和正在進(jìn)行的研究中，各種生物物理和生化信號(hào)已被證明有助于 EV 的治療效果并提高其生產(chǎn)水平。

基于 EV 的治療也面臨著關(guān)于 EV 制劑純度的挑戰(zhàn)。我們使用術(shù)語“MSCs + 細(xì)胞外囊泡 + 外泌體 + 微囊泡”的 PubMed 文獻(xiàn)搜索確定了幾種不同的 EV 分離方法（圖 1）。超過一半的文章僅使用超速離心，約 27% 使用商業(yè)試劑盒，主要基于蛋白質(zhì)沉淀方案。只有大約 19% 的文章使用了某種方法將游離分泌蛋白與 EV 分離（例如，密度梯度、過濾和陰離子交換）。為了使我們對(duì) EV 衍生功能的常識(shí)保持一致，有必要將 MSC 衍生 EV 的真實(shí)成分與分泌蛋白分開研究。生產(chǎn)高純度的 MSC-EV 制劑將加速基礎(chǔ)研究結(jié)果轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐。

圖1?幾種不同的 EV 分離方法

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| 分離 MSC-EV 的實(shí)驗(yàn)方法，目前共有126篇文章用于分析隔離方法，大多數(shù)研究是使用通過超速離心分離的 EV 和 ExoQuick-TC試劑盒等商業(yè)套件進(jìn)行的，TFF，切向流過濾。

在這篇綜述中，研究人員討論了用于治療應(yīng)用的 MSC 衍生的細(xì)胞外囊泡 (MSC-EV) 的開發(fā)。首先，他們將討論 MSC-EV 的成分及其在不同體內(nèi)和體外模型中的作用，然后將討論培養(yǎng) MSC 以改善或改變其分泌 EV 從而提高其治療潛力的一些可能性.

MSC-EV 的治療效力在哪里？

間充質(zhì)干細(xì)胞通過直接的細(xì)胞間串?dāng)_以及通過分泌廣泛的可溶性因子發(fā)揮其在體內(nèi)的作用。MSCs 分泌的主要可溶性介質(zhì)包括細(xì)胞因子、生長因子和 miRNA，它們具有從腫瘤調(diào)節(jié)、免疫抑制和血管生成到組織再生的多種治療作用。

最近，除了這些可溶性因子之外，一些研究小組已經(jīng)開始在 MSCs 的條件培養(yǎng)基 (CM) 中發(fā)現(xiàn)另一種功能成分。研究表明通過超速離心分離的 MSC-CM 可抑制小鼠急性腎小管損傷，這種顆粒狀部分包括納米級(jí)的囊泡結(jié)構(gòu)。

另一組利用通過 HPLC 衍生的過濾排除獲得的 EV 部分，其中包括帶有 EV 標(biāo)記蛋白的囊泡，以減少急性心肌梗塞的大小，這在之前使用 MSC 和可溶性因子的研究中已經(jīng)完成。

除了上述使用 MSC-CM 識(shí)別具有治療功能的 EV 的研究外，還有大約 126 篇已發(fā)表的文章討論了 EV 在各種疾病模型中的治療功能。在這里，我們將重點(diǎn)介紹已被證明具有不同功能效應(yīng)的 MSC-EV 相關(guān)貨物（蛋白質(zhì)和核酸）（圖 2、表 1 和附加文件 1：表 S1）。

圖 2?MSC 衍生 EV 的成分及其相關(guān)的治療潛力

| 不同的圓圈顯示了介導(dǎo) MSC-EV 的免疫調(diào)節(jié)、再生和腫瘤生長作用的建議的泡狀蛋白、mRNA 和 miRNA 成分?？s寫：MSC，間充質(zhì)干細(xì)胞；EVs，細(xì)胞外囊泡；PDGF-D，血小板衍生生長因子-D；COX2，環(huán)氧合酶 2；PGE2，前列腺素 E2；CCR2，C-C 趨化因子受體 2 型；KGF，角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子；Ang-1，血管生成素-1；HGF，肝細(xì)胞生長因子；IGF-1R，胰島素樣生長因子 1 受體；IL-10，白細(xì)胞介素 10；UBR2，泛素蛋白連接酶E3組分n-識(shí)別素2；FGF19，成纖維細(xì)胞生長因子19。

表 1 在動(dòng)物模型和體外針對(duì)各種疾病進(jìn)行的 MSC-EV 相關(guān)研究

MSC-EV 內(nèi)的蛋白質(zhì)效應(yīng)器

EVs 通常包括完整的膜蛋白，如四跨膜蛋白、外周膜蛋白和胞質(zhì)蛋白，并且 EVs 蛋白質(zhì)組成的變化已被證明與重要的功能變化有關(guān)。MSC-EVs 還含有許多蛋白質(zhì)成分，這些蛋白質(zhì)成分被認(rèn)為與許多疾病的康復(fù)有關(guān)。

囊泡蛋白效應(yīng)物已被探索為通過促進(jìn)血管生成來治療缺血和心肌梗塞。例如，來自牙髓來源的 MSCs 的 EV 含有 Jagged-1 配體蛋白，它是 Notch 信號(hào)的激活劑，它們被證明可有效激活血管生成信號(hào)。

含有 Jagged-1 的 EV 會(huì)觸發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞中 Notch 靶基因的轉(zhuǎn)錄變化，導(dǎo)致誘導(dǎo)血管生成和毛細(xì)血管樣管信息，而這種血管生成作用可以用抗 Jagged-1 抗體阻斷。

除此之外，UC-MSC-EVs 已被證明攜帶血小板衍生生長因子-D (PDGF-D)，已被證明可有效協(xié)助梗塞心臟細(xì)胞的組織修復(fù)功能。從轉(zhuǎn)染 PDGF-D-siRNA 的 MSCs 中分離出的 EVs 消除了恢復(fù)，因此表明 PDGF-D/PDGF 受體相互作用可能在 EV 介導(dǎo)的心肌修復(fù)中起關(guān)鍵作用。

在骨再生方面，2018年新加坡國立大學(xué)博士Zhang Shipin等人證明了囊泡 CD73 的治療效果，其中來自胚胎干細(xì)胞衍生的 MSC 的 EV 上存在的 CD73 能夠修復(fù)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)物中的骨軟骨缺損，同時(shí)巨噬細(xì)胞浸潤更多一種抗炎表型。使用 CD73 抑制劑的 Akt 和細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)激酶 (Erk) 信號(hào)傳導(dǎo)證實(shí)了 CD73 在 EV 中的作用。

 

此外，還進(jìn)行了一項(xiàng)神經(jīng)元再生研究，以研究 BM-MSC-EVs 治療外傷性和退行性眼病的效果。結(jié)果表明，攜帶 argonaute-2 (AGO-2) 蛋白的 EV 促進(jìn)了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的顯著存活和軸突的再生。在敲除 AGO-2 后，來自 MSCs 的 EV 減弱了這種影響，這表明 AGO-2 參與了 EV 的再生作用。

基于 MSCs 眾所周知的免疫調(diào)節(jié)作用，MSC-EVs 也被描述為抗炎劑，從而使 EVs 用于治療包括腎損傷在內(nèi)的免疫疾病合理化。美國德克薩斯大學(xué)麥戈文醫(yī)學(xué)院的MT Harting等人研究表明 BM-MSC-EVs 中環(huán)氧合酶 2 和前列腺素 E2 的表達(dá)增加，這些成分部分導(dǎo)致脾細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的減弱。

此外，促炎細(xì)胞因子 CCL2 通過其存在于 BM-MSC-EVs 上的受體的淬滅作用導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活化減少并有助于修復(fù)急性腎損傷 。此外，通過 EV 遞送 14-3-3ζ 可防止通常由化療藥物順鉑引起的自噬小管上皮細(xì)胞損傷。

有趣的是，MSC 衍生的 EV 不僅在可用于治療的組織修復(fù)和抗炎作用方面有益，而且癌細(xì)胞可以有效地利用 MSC 的功能來實(shí)現(xiàn)自身的生長和免疫逃逸。例如，BM-MSC-EV 中存在的成纖維細(xì)胞生長因子 19 可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞生長。同樣，BM-MSC-EVs 可以傳遞泛素蛋白連接酶 E3 組分 n-識(shí)別素 2，對(duì)胃癌細(xì)胞具有增殖和遷移作用。

總體而言，MSCs 的蛋白質(zhì)貨物可以通過淬滅一些促炎因子或通過增強(qiáng)抗炎因子直接發(fā)揮功能作用。其中一些影響可能是與其他貨物的組合影響，因此將這些組件逐一剖析是設(shè)計(jì)更有效的 MSC-EV 的一種方式。

MSC-EV 內(nèi)的核酸

a.NDA)(脫氧核糖核酸)

在 EV 中可以找到多種形式的核酸，包括 DNA、mRNA 和 miRNA。EVs中DNA的存在和定位仍然存在爭(zhēng)議，沒有研究表明DNA參與MSC-EVs的治療效果。有趣的是，盡管描述了存在于其他來源的囊泡中的外源 DNA 的促炎作用以及 MSC 對(duì)它們的攝取，但我們沒有發(fā)現(xiàn)任何由 MSC-EV 相關(guān) DNA 誘導(dǎo)的炎癥報(bào)告，這表明這些EV 的免疫抑制特性可能會(huì)克服這種可能的影響，或者與 MSC-EV 相關(guān)的有害 DNA 較少。

b.mRNA

與一長串研究相比，很少有研究將治療效果歸因于 mRNA，這些研究至少顯示特定 miRNA 與觀察到的結(jié)果之間的相關(guān)性，如表 1 所示。EV 中核酸的化學(xué)計(jì)量和每種 miRNA 的最小濃度在受體細(xì)胞中促進(jìn)強(qiáng)大作用所需的 mRNA 或 mRNA 仍然是一個(gè)深入研究的主題。

在急性肺損傷模型和肺炎中，角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子 (KGF) 的 mRNA 與 MSC-EV 治療觀察到的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。在這些研究中，抗 KGF 中和抗體的施用以及治療消除了最初觀察到的對(duì)存活的有益作用，并且用針對(duì) KGF 轉(zhuǎn)錄物的 siRNA 預(yù)處理 MSCs 也部分抑制了 MSC-EVs 的抗炎作用，如支氣管肺泡所證明的那樣。灌洗液細(xì)胞結(jié)構(gòu)和炎性細(xì)胞因子的存在。

作者進(jìn)一步假設(shè)血管生成素-1（在 MSC-EV 中也很豐富）的轉(zhuǎn)錄本通過在體外和小鼠模型中使用 MSC-EV 在恢復(fù)肺蛋白通透性和解決炎癥方面發(fā)揮重要作用急性肺損。事實(shí)上，在這些模型中，MSCs 或 MSC-EVs 的 angiopoietin-1 siRNA 預(yù)處理導(dǎo)致人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)和通透性恢復(fù)降低。

在急性腎損傷的體外模型中，有研究人員提出了肝細(xì)胞生長因子 mRNA 的特殊作用，因?yàn)橛?RNase 處理的囊泡在促進(jìn)腎小管細(xì)胞的去分化和隨后的生長方面無效。在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷的另一個(gè)體外模型中，發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子 1 受體的 EV 相關(guān) mRNA 對(duì)于保護(hù)近端腎小管上皮細(xì)胞很重要。在類似的順鉑誘導(dǎo)的體外模型中，還發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素 (IL)-10 mRNA 通過 MSC-EV 轉(zhuǎn)移。

此外，發(fā)現(xiàn)用于合成 VII 型膠原的 mRNA 與膠原蛋白本身一起在體外轉(zhuǎn)移到隱性營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解細(xì)胞中。這種情況的特點(diǎn)是 VII 型膠原基因的功能喪失突變，因此 MSC-EV 可能是治療這種疾病的潛在方法。

c. miRNA

 

越來越多的證據(jù)表明 MSC-EV 中包含的 miRNA 的有效性。圖 2 和表 1 顯示了許多參與 MSC-EV 在不同疾病條件下的治療效果的 miRNA。

由于 miRNA 領(lǐng)域在癌癥相關(guān)研究中得到了最廣泛的探索，因此已知其中一些 miRNA 被上調(diào)或被認(rèn)為是特定癌癥類型的標(biāo)志物。然而，這并不一定意味著 EV 中這些 miRNA 的存在代表了促腫瘤風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)樗ǔＪ嵌喾N因素的組合，對(duì)于確定每個(gè)分子在該過程中的最終作用很重要。然而，重要的是要記住，當(dāng)體內(nèi)缺乏抑癌基因時(shí)，致癌分子可能會(huì)通過 EV 轉(zhuǎn)移并可能影響腫瘤的發(fā)展。另一方面，這種轉(zhuǎn)移在非突變細(xì)胞中可能只有短暫的影響。

一般而言，在最常與 MSC-EV 的治療特性相關(guān)的 miRNA 中，miR-21、miR-19a 和 miR-210 與心血管疾病有關(guān)；miR-let-7b、miR-125a 和 miR-21 與傷口愈合有關(guān)；miR-21、miR-17-92 和 miR-133b 與神經(jīng)損傷有關(guān)；miR-223、miR-146a 和 miR-let-7c 與保護(hù)肝臟和腎臟損傷有關(guān)；miR-221、miR-1587 和 miR-23b 與癌癥相關(guān)效應(yīng)有關(guān)（圖 2）。在這里，我們將深入討論一些最常被認(rèn)為是 MSC-EV 效應(yīng)的可能介質(zhì)的 miRNA。

• miR-21

 

鑒于已顯示 miR-21 通過刺激增殖和抑制不同細(xì)胞類型的細(xì)胞凋亡來調(diào)節(jié)細(xì)胞存活 ，這種 miRNA 的貢獻(xiàn)與 MSC-EV 介導(dǎo)的各種疾病模型中的治療效果有關(guān)。BM-MSCs 已被證明可通過 EV 傳遞外源性 miR-21，從而防止髓核細(xì)胞凋亡并減少椎間盤退變。此外，已顯示 miR-21 在缺氧條件下在 MSC-EV 中的表達(dá)增加，注射這些 MSC-EV 可以減少小鼠的認(rèn)知和記憶障礙，同時(shí)減少斑塊沉積和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。

 

研究人員進(jìn)一步描述了 miR-21 的功能，來自富含 miR-21 的 UC-MSC 的 EV 在抑制肌成纖維細(xì)胞形成從而防止過度瘢痕形成方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。在這些 EV 中阻斷 miR-21 會(huì)消除 EV 抑制肌成纖維細(xì)胞形成的能力，這表明這種特定的 miRNA 對(duì)于 MSC 的抗瘢痕形成功能至關(guān)重要。

 

miR-21 也被描述為在心臟損傷中具有保護(hù)作用。源自 BM-MSCs 的 EV 在過氧化氫誘導(dǎo)的氧化后具有增加的 miR-21 水平，并且囊泡 miR-21 可以被轉(zhuǎn)運(yùn)至心臟干細(xì)胞，從而在功能上抑制磷酸酶和張力蛋白同源物 (PTEN) 的表達(dá)，從而防止氧化壓力觸發(fā)的細(xì)胞死亡。

 

另一項(xiàng)研究表明，通過抗 miR 治療對(duì) miR-21 的選擇性拮抗消除了 MSC-EV 的抗凋亡和血管生成作用，隨后上調(diào)了 miR-21 靶標(biāo) PTEN，這表明 miR-21 可能是MSC-EVs 對(duì)心血管疾病的治療作用。

 

• miR-145

 

miR-145 與細(xì)胞分化過程以及平滑肌細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的激活有關(guān)。此外，miR-145 通常被描述為具有腫瘤抑制作用。與這些發(fā)現(xiàn)一致，MSC-EV 中 miR-145 的上調(diào)已被證明對(duì)皮膚缺損愈合有效，并且在前列腺癌中具有抗腫瘤作用。

 

miR-145 在 UC-MSC（臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞） 衍生的 EV 中富集，這是通過高通量 RNA 測(cè)序確定的。EVs 中 miR-145 的過表達(dá)可以抑制腫瘤生長因子 (TGF)-β/SMAD2 的激活，從而抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化，而這種 miRNA 的消耗極大地消除了 EVs 抑制 TGF-β 的能力/SMAD2 通路。

 

在癌癥預(yù)防方面，AD-MSC（脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞）衍生的 EVs 通過細(xì)胞凋亡顯著抑制轉(zhuǎn)移性前列腺癌的增殖，這種作用被 miR-145 敲低所抵消，導(dǎo)致 Caspase 3/7 的表達(dá)減少和抗凋亡蛋白的表達(dá)增加。有趣的是，UC-MSC 分泌的 EV 已被證明通過抑制病毒感染來抑制丙型肝炎病毒 (HCV) 感染，這主要?dú)w因于 miR-145 抑制病毒 RNA 復(fù)制[66]。

 

• miR-221

 

與 miR-145 相比，miR-221 在癌癥進(jìn)展中的促進(jìn)作用近年來已得到廣泛認(rèn)可。例如，肝細(xì)胞癌中的 CD44 表達(dá)由 miR-221 通過 PI3K-Akt-mTOR 通路控制。此外，miR-221 可以通過靶向金屬肽酶 2 的組織抑制劑來支持非小細(xì)胞肺癌。

 

同樣，已證明 miR-221 在 BM-MSC（骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞） 的 EV 中的高表達(dá)可有效增加胃癌細(xì)胞遷移、侵襲和與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附。另一項(xiàng)使用 miR-221 的研究表明，MSC-EV 中上調(diào)的 miR-221 以與上述 miR-145 相似的方式保護(hù)免受 HCV。

 

如何使基于 MSC 的療法更有效？

 

生物物理信號(hào)

 

MSCs 已被證明受到各種不同的生物物理和生化信號(hào)的刺激（圖 3）。生物物理誘導(dǎo)劑包括電脈沖、低功率激光照射、非相干紅光、電磁場(chǎng)暴露、機(jī)械信號(hào)（例如，流體、張力和壓力）和底物形貌和剛度、2D 和 3D 支架/無支架培養(yǎng)和磁力。

 

通過這些不同的治療，MSCs 可能會(huì)顯著改變其表型并開始分化成特定類型的細(xì)胞，這對(duì)于組織再生等一系列應(yīng)用非常有用，尤其是在對(duì)間充質(zhì)起源器官的損傷中。

 

然而，MSC 培養(yǎng)的生物物理參數(shù)中的一些變化也會(huì)影響它們的分泌譜，而不會(huì)促進(jìn)完全分化。例如，這些治療中的許多可以增加 MSCs 的增殖，但人們對(duì)它們對(duì) EV 分泌或免疫調(diào)節(jié)能力的影響知之甚少，留下了廣泛的條件有待探索，以試圖增加 MSC-EV 產(chǎn)量和控制他們的內(nèi)容。

 

圖3：各種條件對(duì)細(xì)胞外囊泡生產(chǎn)和功能的影響

 

| 培養(yǎng)條件和外部刺激對(duì) MSC-EV 分泌譜和功能變化的影響。MSC，間充質(zhì)干細(xì)胞；EVs，細(xì)胞外囊泡；LPS，脂多糖。

 

在一項(xiàng)針對(duì) I 型膠原支架中 3D 培養(yǎng)的 MSC 與普通 2D 培養(yǎng)的 EV 的研究中，作者使用商業(yè)試劑盒從其上清液中分離出 EV，發(fā)現(xiàn)在促進(jìn)功能恢復(fù)和免疫調(diào)節(jié)方面有更多的蛋白質(zhì)和更好的結(jié)果。從 3D 培養(yǎng)細(xì)胞中分離的樣本中的創(chuàng)傷性腦損傷模型。

 

另一個(gè)可以影響 EV 產(chǎn)量的 MSC 培養(yǎng)參數(shù)是細(xì)胞接種密度，較低的密度與較高的產(chǎn)量有關(guān)。然而，尚不清楚這些影響是否與細(xì)胞間接觸有關(guān)，因?yàn)樵谕粫r(shí)間段內(nèi)多次收集而不是一次收集也會(huì)增加可收集的 EV 數(shù)量。細(xì)胞培養(yǎng)物中存在的 EV 或代謝物有可能在生化上降低 MSC 的 EV 產(chǎn)生和/或分泌。

 

生物化學(xué)信號(hào)

 

人們認(rèn)為，MSCs 對(duì)脂多糖等細(xì)菌衍生分子和響應(yīng)這些分子釋放的細(xì)胞因子有反應(yīng)，可以提高其對(duì)炎癥環(huán)境的治療效果。最近，在炎癥條件下由 MSC 產(chǎn)生的 EV 變得越來越重要。

 

一項(xiàng)研究已經(jīng)表明，脂多糖刺激增加了 UC-MSCs 的 EV 分泌，并增強(qiáng)了 M2 巨噬細(xì)胞極化和糖尿病皮膚傷口愈合。越來越多的證據(jù)表明，炎性細(xì)胞因子可能會(huì)增強(qiáng) MSC-EV 的治療效果。

 

來自 IL-1β 預(yù)處理的 UC-MSCs 的 EV 顯示出比來自未經(jīng)處理的 MSCs 的 EV 具有更大的免疫調(diào)節(jié)作用，這表明更多的功能分子（如 miR-146a）嵌入到來自 IL-1β 預(yù)處理的 MSCs 的 EV 中。與此一致，在存在腫瘤壞死因子 α、干擾素 γ 或 TGF-β 的情況下培養(yǎng)的 MSC-EV 導(dǎo)致脾細(xì)胞中的細(xì)胞因子表達(dá)顯著降低，并強(qiáng)烈增加調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞分化，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。

 

MSC-CM包括各種生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子和PDGF，它模擬了與完整細(xì)胞相關(guān)的有益作用。研究人員利用AD-MSC-EVs的血管生成潛力進(jìn)行再生醫(yī)學(xué)的工作基礎(chǔ)上，證實(shí)了用PDGF預(yù)刺激誘導(dǎo)的治療效果增加。

 

另外，與未經(jīng)處理的EVs相比，用紅細(xì)胞生成素的激素刺激增加了EVs的產(chǎn)生，并增強(qiáng)了EVs在腎臟損傷后的保護(hù)作用。此外，缺氧和缺血條件已被證明可以改變間充質(zhì)干細(xì)胞在EV功能方面的特征。

 

據(jù)報(bào)道，缺氧預(yù)處理使BM-MSCs增加EVs的產(chǎn)生，并且這些EVs通過刺激新生血管而在心臟保護(hù)方面有卓越的活性。另外，在一氧化氮刺激期間，間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的EVs已被證明能增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成作用，并能恢復(fù)后肢缺血的肢體功能。

 

此外，將紫杉醇納入BM-MSC-EVs被證明可以在體外抑制腫瘤的生長。此外，培養(yǎng)基的血清含量被發(fā)現(xiàn)可以改變MSC的特性和釋放的EVs的RNA含量，這表明MSC-EVs可以被調(diào)控，以包含不同的活性成分用于未來的治療應(yīng)用。

 

來自分化細(xì)胞的 EVs 能夠改變 MSCs 的特性。來自神經(jīng)元細(xì)胞的 EV 可通過 miR-125b 轉(zhuǎn)移介導(dǎo) MSC 神經(jīng)元誘導(dǎo)，而內(nèi)皮細(xì)胞衍生的 EV 影響 MSC 增殖和遷移，為 EV 作為內(nèi)皮細(xì)胞和 MSC 之間的通信通道提供了證據(jù) 。

 

此外，肥大細(xì)胞衍生的 EV 通過囊泡相關(guān)的 TGF-β 調(diào)節(jié) MSC 功能，在卵白蛋白誘導(dǎo)的過敏模型中誘導(dǎo)抗炎作用。源自腫瘤細(xì)胞的 EV 也可以調(diào)節(jié) MSC 表型。例如，來自癌癥干細(xì)胞的 EVs 誘導(dǎo) MSCs 中的化學(xué)吸引增加，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展，而來自肺癌細(xì)胞的 EVs 刺激 MSCs 中 IL-6、IL-8 和單核細(xì)胞趨化蛋白 1 的產(chǎn)生和分泌，從而灌輸 MSCs具有更多的腫瘤支持特征。

 

然而，盡管這些來自分化細(xì)胞的 EV 很可能能夠調(diào)節(jié) MSC 進(jìn)一步產(chǎn)生 EV，但就 MSC-EV 而言，其他類型的 EV 如何影響 MSC 功能還沒有明確的研究。因此，需要研究其他細(xì)胞衍生的 EV 在 MSC 分泌 EV 方面的作用，以獲得最佳治療效果。

 

MSC的細(xì)胞重編程

 

盡管 MSC-EVs 具有很強(qiáng)的治療作用，但仍需要進(jìn)一步了解 MSCs 的基因修飾如何提高分泌型 EVs 的治療效力。研究人員目前正試圖通過蛋白質(zhì)和 miRNA 的過表達(dá)來開發(fā)治療上更優(yōu)化的 MSC。在這里，作者將重點(diǎn)關(guān)注轉(zhuǎn)基因 MSC-EV 如何顯示改變的貨物和改善的功能效果。

 

a. MSCs中過表達(dá)蛋白

 

大多數(shù)在 MSCs 中過表達(dá)的蛋白質(zhì)都是轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)分子。MSC 通常具有有限的擴(kuò)展能力，因此 研究人員通過誘導(dǎo) c-Myc 的過表達(dá)創(chuàng)造了永生化的 MSC。

 

在嚴(yán)格的 GMP 條件下，從這些永生化細(xì)胞生產(chǎn) EV 是可擴(kuò)展的，這使得這些 EV 能夠用于臨床。另一項(xiàng)研究表明，BM-MSC 中 GATA-4 轉(zhuǎn)錄因子的過表達(dá)增加了其分泌的 EV 改善心臟功能的能力。

 

與來自對(duì)照 MSC 的 EV 相比，此類 EV 可以轉(zhuǎn)移更多的 miR-19a，從而在小鼠模型中恢復(fù)心臟收縮功能并減少梗塞面積。此外，缺氧誘導(dǎo)因子 1-α (HIF-1α) 轉(zhuǎn)錄因子通常在缺血期間穩(wěn)定并上調(diào)多種心臟保護(hù)基因，這導(dǎo)致研究人員在牙科中突變 HIF-1α 基因（抗氧形式）用于治療缺血相關(guān)疾病的牙髓來源的 MSCs。

 

與對(duì)照 EV 相比，來自過表達(dá) HIF-1α 的 MSC 的 EV 具有增加的 EV 標(biāo)記蛋白（如四跨膜蛋白）和增加的血管生成活性，這導(dǎo)致小鼠模型中心臟組織的修復(fù)增加。

 

一項(xiàng)類似的研究表明，源自過度表達(dá) HIF-1α 的 BM-MSCs 的 EV 能夠促進(jìn)骨再生并減少類固醇誘導(dǎo)的股骨頭缺血性壞死。諸如 Akt 之類的信號(hào)分子已在 MSCs 中被利用以提高其有效性。

 

來自過表達(dá) Akt 的 UC-MSC 的 EV 比對(duì)照 EV 含有更高水平的 Akt，這會(huì)導(dǎo)致加速內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管形成，從而提高心臟修復(fù)的效率。這種作用是由促進(jìn)缺血性心臟血管生成的內(nèi)皮細(xì)胞中增強(qiáng)的 PDGF-D 產(chǎn)生介導(dǎo)的。在 CM 中觀察到過表達(dá) Akt 的 MSC-EV 的這些心臟保護(hù)作用的一些跡象，這些作用歸因于分泌的卷曲相關(guān)蛋白。

 

間充質(zhì)干細(xì)胞位于腫瘤細(xì)胞附近，據(jù)報(bào)道參與腫瘤進(jìn)展。人們普遍認(rèn)為，腫瘤微環(huán)境可以改變 MSC-EV 的含量，并導(dǎo)致它們趨向于更促腫瘤的表型。例如，科學(xué)家Roccaro 等人，表明來自多發(fā)性骨髓瘤患者的 BM-MSC-EVs 與來自正常健康受試者的 EVs 具有不同含量的腫瘤抑制 miRNAs，并且這些來自患者的 EVs 促進(jìn)了多發(fā)性骨髓瘤腫瘤的生長，而來自健康個(gè)體的 EVs 抑制了腫瘤細(xì)胞的生長。

 

因此，還研究了 MSCs 的遺傳修飾如何影響腫瘤生長。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體 (TRAIL) 已被證明是一種有前途的癌癥治療藥物，基于此，科學(xué)家Tuan 等人將該基因轉(zhuǎn)染到 MSCs 中，然后測(cè)量源自這些細(xì)胞的 EVs 的癌細(xì)胞殺傷功效。

 

這種 EV 裝飾有高表達(dá)的 TRAIL，并在各種癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但在原發(fā)性支氣管細(xì)胞中沒有。除了基因過表達(dá)外，腫瘤相關(guān)基因敲低的作用也在 BM-MSCs 中得到表征。來自 p53 缺陷的 BM-MSCs 的 EV 富含促進(jìn)胃癌進(jìn)展的 UBR2 蛋白。這種間接將 UBR2 靶向靶細(xì)胞的 p53 癌基因的調(diào)節(jié)通過調(diào)節(jié) Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑增強(qiáng)了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

 

b. MSCs中miRNA過表達(dá)

 

使用靶向轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的 miRNA 可能為治療許多疾病提供一種新的選擇。然而，miRNA 治療的進(jìn)展受到阻礙將 miRNA 遞送至靶器官的障礙。EV 已成為傳遞 miRNA 的有效載體，因此許多研究人員一直在設(shè)計(jì) MSC 以將 miRNA 加載到 EV 中并看到了有效的治療效果（表 2）。

 

表2，在體外和體內(nèi)模型中進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)染MSC研究

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| 縮寫：MSC 間充質(zhì)干細(xì)胞、H 人、M 小鼠、R 大鼠、BM 骨髓、AD 脂肪組織、UC 臍帶、SYN 滑膜

 

小鼠腎損傷和肝纖維化模型用于研究 EV 介導(dǎo)的 miR-let7c 和 miR-122 的抗纖維化作用。在這個(gè)小鼠模型中，從 MSCs 釋放的 EVs 被設(shè)計(jì)為過度表達(dá) miR-let7c，其中包含豐富的 miR-let7c，能夠減輕腎損傷并顯著下調(diào) TGF-β1 和腎臟中下游纖維化基因的表達(dá)，因此提供了使用工程化 MSC 通過 EV 治療性遞送 miRNA 的主要例子。

 

鑒于 miR-122 通過負(fù)向調(diào)節(jié)肝細(xì)胞增殖在肝纖維化中起關(guān)鍵作用，miR-122 在 AD-MSCs 中被修飾以產(chǎn)生 miR-122 水平增加的 EV。這些 EV 通過 miR-122 誘導(dǎo)的靶基因（如胰島素樣生長因子受體 1、細(xì)胞周期蛋白 G-1 和脯氨酰-4-羥化酶 α-1）的下調(diào)介導(dǎo) MSC 和肝星狀細(xì)胞之間的通訊。

 

除了 EV 相關(guān)的 miR-122 的抗纖維化作用外，相同的含有 miR-122 的 EV 使肝細(xì)胞癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的化學(xué)治療作用更敏感。與此一致，其他 miRNA 修飾已被證明賦予 MSC-EV 抗腫瘤作用。為了減輕將 miRNAs 靶向多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的困難，臍帶Wharton’s jelly源間充質(zhì)干細(xì)胞(WJ-MSCs) 用 miR-124 過表達(dá)，衍生的 EVs 增強(qiáng)了對(duì)替莫唑胺的化學(xué)敏感性并減少了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移。

 

在另一項(xiàng)研究中，過表達(dá) miR-146b 的大鼠腦 MSC-EV 被用于減少膠質(zhì)瘤異種移植物的腫瘤負(fù)荷，并且這些 EV 的腫瘤內(nèi)給藥減少了大鼠腦中膠質(zhì)瘤的生長。

 

miR-17-92 和 miR-133 的神經(jīng)保護(hù)活性已在來自表達(dá) miRNA 的 MSCs 的 EV 中增強(qiáng)。從轉(zhuǎn)染 miR-17-92 的 MSCs 中收獲的 EV 顯示出皮質(zhì)神經(jīng)元的軸突生長顯著增加，其特征是與對(duì)照 EV 相比具有更高的軸突伸長速度。

 

在腦出血大鼠模型中，含有 miR-133 的 MSC-EV 能夠產(chǎn)生有助于阻止神經(jīng)元退化的促生存信號(hào)反應(yīng)，這是通過抑制 RhoA 和激活 Erk172/cAMP 反應(yīng)來介導(dǎo)的元件結(jié)合蛋白。

 

研究還檢查了 MSC-EV 在不同疾病模型中傳遞的 miRNA 的再生作用。來自過表達(dá) miR-223 的 BM-MSCs 的 EVs 用于自身免疫性肝炎的小鼠模型，EVs 可以通過 miR-223 誘導(dǎo)的靶細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)和含有 3 和 caspase-1 的 NLR pyrin 結(jié)構(gòu)域的下調(diào)來預(yù)防肝損傷活動(dòng)。

 

此外，一項(xiàng)對(duì)源自過表達(dá) miR-140-5p 的人類滑膜 MSCs 的 EV 的研究表明，在大鼠模型中增強(qiáng)了軟骨組織再生并減少了膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎，并且源自過表達(dá) miR-126 的人類滑膜 MSCs 的 EVs 愈合了糖尿病大鼠模型中的全層皮膚缺損。

 

結(jié)論和觀點(diǎn)

 

關(guān)于EV 成分與 EV 生物效應(yīng)之間的關(guān)系，最常見的分子是蛋白質(zhì)和 miRNA。已經(jīng)研究了各種用特定蛋白質(zhì)和核酸外源加載分離的 EV 的策略，例如，電穿孔、凍融循環(huán)、皂苷介導(dǎo)的加載和低滲透析。

 

此外，許多團(tuán)體已經(jīng)開始使用轉(zhuǎn)基因 MSCs 將所需的貨物包裝在 EV 中，這些轉(zhuǎn)基因 MSCs 經(jīng)過基因改造以過度表達(dá)某些蛋白質(zhì)和 miRNA。然而，這需要優(yōu)化條件，以使轉(zhuǎn)基因細(xì)胞外囊泡獲得更有效的功能特性。此外，還需要對(duì) EV 成分的質(zhì)量控制以及這些 EV 的安全性和有效性進(jìn)行全面研究，然后才能將其用于臨床應(yīng)用。

 

在討論 MSC-EV 相對(duì)于 MSC 的優(yōu)勢(shì)之前，必須考慮對(duì)以下問題進(jìn)行仔細(xì)調(diào)查的必要性。許多臨床試驗(yàn)已經(jīng)描述了各種外部因素對(duì) MSCs 特性的影響。

 

供體變異、衰老、細(xì)胞培養(yǎng)方法和免疫原性的細(xì)微差異被證明會(huì)導(dǎo)致 MSC 治療的功能改變。例如，經(jīng)歷細(xì)胞衰老的 MSCs 會(huì)促進(jìn)代謝功能障礙并失去其間充質(zhì)可塑性和抗炎作用，這可能導(dǎo)致 MSC 治療失敗。據(jù)作者所知，沒有研究評(píng)估 EV 治療活性與 MSC 衰老之間的關(guān)系。然而，在對(duì) EVs 進(jìn)行功能評(píng)估時(shí)，還需要進(jìn)一步研究衰老細(xì)胞的含量，深入了解相關(guān)機(jī)制將有助于成功開發(fā) MSC-EVs 用于臨床。

 

總之，MSCs 通過各種囊泡成分以及細(xì)胞本身及其分泌的可溶性因子具有潛在的治療功能，并且 MSCs 可以進(jìn)行修飾以提高其產(chǎn)生的 EV 的數(shù)量和有效性。因此，MSC 衍生的 EV 可以用作強(qiáng)大的治療劑，在許多不同的疾病中提供抗炎和再生化合物。未來的工作將集中在開發(fā)生物工程 MSC，以顯著提高 EV 的產(chǎn)量，從而安全地轉(zhuǎn)移各種有效的治療分子。