間充質干細胞外泌體在調控組織再生中的重要作用和機制

前言：2019年1月10日，國家藥監局發出通知，EGF屬于化妝品領域非法添加原料。原因是國家藥監局說明了寡肽-1與人寡肽-1（表皮生長因子，EGF）的區別，以及EGF在醫學臨床上的應用范圍和效果。一句話，國家之所以禁止EGF添加是因為EGF是單向地刺激細胞增生，甚至是無序地刺激細胞增生，一味不停地刺激細胞增生可能會導致皮膚細胞出現難于預測的問題，甚至是組織過度增生和癌變。那么外泌體（Exosomes）在調控組織再生的過程是否也存在這樣的問題呢？

外泌體可顯著增強組織再生，促進膠原蛋白的生成

大量研究表明，間充質干細胞的外泌體（MSC-Exo）可顯著增強組織再生，促進膠原蛋白的生成。然而，MSC-Ex是否能控制干細胞在組織再生過程中的增殖，以防止組織過度增生和異常增生的問題仍有待探討。研究發現外泌體通過調節YAP控制皮膚再生作為該信號的“剎車”，防止組織過度增生。

國際頂級行業期刊Stem cells雜志曾在線發表了我國科學家江蘇大學醫學院院長許文榮教授關于外泌體在調控組織再生中的相關研究工作，該研究發現人類臍帶間充質干細胞（hucMSC）外泌體中14-3-3zeta可介導YAP和P-LATS結合形成一個復合物促進YAP的磷酸化，與皮膚再生過程中外泌體Wnt4信號相互協作。(Zhang, B., et al. (2016). “HucMSC Exosome-Delivered 14-3-3zeta Orchestrates Self-control of the Wnt Response via Modulation of YAP during Cutaneous Regeneration.” Stem Cells.)

首先，通過評估hucMSC-Ex治療大鼠深Ⅱ度燒傷的作用，發現hucMSC-Ex在皮膚的再生重塑階段促進Wnt/β-catenin信號通路的自我調節。HucMSC-Ex在第4周限制過多的皮膚細胞擴張和膠原沉積。在高密度的條件下，hucMSC-Ex通過誘導YAP磷酸化抑制Wnt/β-catenin信號。

其次，hucMSC-Ex的蛋白質組學分析表明，14-3-3蛋白可以通過外泌體運輸。gain-和loss-of-function的研究結果表明，hucMSC外泌體14-3-3zeta可調控YAP活力及其Ser127位點的磷酸化，這一過程需要YAP和P-LATS的相互作用。進一步研究表明，在高密度細胞狀態下，14-3-3zeta招募YAP和P-LATS形成復合體，14-3-3zeta是這個復合物的關鍵調控分子。

這些結果綜合表明，hucMSC-Ex的功能不僅可作為Wnt/β-catenin信號的“加速器”以促進受損皮膚組織的再生修復，而且可通過調節YAP控制皮膚再生作為該信號的“剎車”。

間充質干細胞外泌體在組織再生中作用和機制

組織工程利用工程學和生命科學的原理開發受損組織生物替代品, 以達到恢復、維持或改善組織功能的目的。組織再生有3個基本要素, 即干細胞、生長因子和支架。間充質干細胞( MSCs)是一類具有自我更新、多向分化和免疫調節性能的成體多潛能干細胞群, 是組織再生的重要種子細胞。但是, 越來越多的證據表明, 應用于組織再生的外源性MSCs在植入后短時間內即出現大量凋亡。此外, MSCs的應用還受到干細胞提取、運輸保存等技術條件以及倫理問題等諸多限制。

19世紀80年代, PAN研究組首次發現并命名羊網織紅細胞分泌的一些小囊泡為外泌體。外泌體來源于胞內體, 胞內體內陷形成多囊泡體, 多囊泡體與細胞膜結合, 釋放到細胞外, 形成外泌體。外泌體直徑約為40~100 nm, 電子顯微鏡下呈板狀或杯狀, 由雙層磷脂分子包圍而成。外泌體含有豐富的蛋白質、RNA及DNA等, 這些活性成份能夠在細胞間被穩定地轉運, 介導細胞之間的信息交流。

2010年, 有學者首次報道了間充質干細胞釋放的外泌體(mesenchymal stem cells-derived exosomes, MSC-Exo)能提高小鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞活力, 證明了MSCs培養基中具有心肌保護功能的成分是外泌體。外泌體作為微小RNA(microRNA, miRNA)載體, 具有在細胞間傳遞miRNA的特性, 應用MSC-Exo治療心肌梗死有望替代干細胞治療。研究發現, 在體外肝損傷模型中, MSC-Exo具有低毒性和良好的細胞恢復活性, 并能減少細胞氧化應激, 發揮潛在的抗氧化作用, 而且富含生物活性分子的MSC-Exo參與肝衰竭模型損傷肝組織的修復。

（外泌體調控組織再生）

MSC-Exo外泌體源自細胞內吞途徑的微膜囊泡, 是MSCs旁分泌效應的主要介導因子。MSC-Exo比單一細胞因子具有更強而復雜的信號分子轉運和調控能力, 可能是干細胞發揮調控的重要途徑。與細胞治療相比, 從MSCs條件培養基中提取的外泌體具有低免疫原性, 相對更安全高效。

1 MSC-Exo通過增強細胞增殖和遷移、抑制凋亡促進組織再生

在組織再生中, MSC-Exo主要通過刺激細胞增殖, 抑制細胞凋亡, 誘導細胞活化發揮作用。研究表明, MSC-Exo能夠誘導神經細胞、成熟神經元細胞和內皮細胞增殖, 減輕大腦局部的炎癥反應, 修復小鼠創傷性腦損傷。MSC-Exo可以促進肝臟細胞增殖, 促進肝臟切除的小鼠肝臟組織再生。有學者發現, 與單純的磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate, β-TCP)支架相比, 外泌體β-TCP復合支架能夠更好地促進成骨分化。體外實驗結果顯示, 外泌體能夠從β-TCP支架釋放并被人骨髓干細胞(bone marrow stem cells, BMSCs)攝取, 被攝取到BMSCs中的外泌體能夠促進BMSCs的增殖、遷移和成骨分化?；虮磉_譜和生物信息學分析表明, 外泌體β-TCP復合物支架顯著改變了PI3K/Akt信號通路的基因表達, 而且功能性研究進一步證明了PI3K/Akt信號通路是外泌體誘導BMSCs成骨分化的分子機制所在。

人脂肪干細胞外泌體與聚乳酸-乙醇酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid, PLGA)支架結合后能緩慢穩定地釋放, 并提高人BMSCs在體外的成骨、增殖和遷移能力, 體內實驗結果表明這種無細胞系統能顯著促進骨再生, 主要與促進BMSCs在新形成的骨組織中遷移和歸巢的能力有關。因此, 由人脂肪干細胞外泌體和聚多巴胺涂層PLGA支架組成的新型無細胞系統為骨組織工程提供了一種新的治療模式, 在修復骨缺損領域具有廣闊的應用前景。此外, 有學者應用miRNA-5p過表達滑膜MSCs提取的外泌體對骨關節炎進行治療, 發現能有效提高軟骨細胞的增殖和遷移能力, 同時抑制細胞外基質的分泌, 這一作用是通過Wnt信號通路介導的。

研究發現, MSC-Exo對藥物性肝炎及肝損傷的修復作用是通過抑制細胞凋亡蛋白酶同時上調抗凋亡基因表達實現的。在體外實驗中, 外泌體能降低小鼠肝損傷后谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的表達, 修復肝損傷; 在體內實驗中, 外泌體能夠誘導肝細胞由G0期重新進入G1期, 以促進細胞增殖。

2 MSC-Exo通過提高血管生成能力促進組織再生

有學者分離并鑒定了人臍帶間充質干細胞的外泌體(human umbilical cord mesenchymal stem cell exosome, hucMSC-Exo), 發現一定劑量的hucMSC-Exo能夠促進內皮細胞的增殖、遷移, 從而促進血管生成。在大鼠的皮膚燒傷模型中, 一定濃度的hucMSC-Exo能夠提高β-catenin在細胞核中的積聚和穩定性。用不同濃度的hucMSC-Exo處理EA.hy926細胞12 h后, PCNA和cyclin D3蛋白表達隨hucMSC-Exo的劑量增加而增加; 利用shRNA沉默hucMSC中Wnt4基因后, 提取無Wnt4基因hucMSC-Exo作用于EA.hy926細胞, 發現hucMSC-Exo促血管生成作用被明顯抑制, 內皮細胞標記物CD31的表達明顯下調。提示Wnt4/β-Catenin信號通路在hucMSC-Exo促進傷口愈合和血管再生中發揮重要作用。

目前認為外泌體是Wnt胞外轉運和分泌的潛在載體?；虮磉_水平測序發現Wnt5a和Wnt5b在滑膜間充質干細胞(?SMSCs)中高表達, 而其他Wnt蛋白幾乎不表達, 且Wnt5a和Wnt5b主要富集在SMSC-Exo中, SMSC-Exo通過Wnt信號通路提高了YAP信號分子促血管生成的活化作用。

外泌體中含有mRNA、miRNA以及各種抗凋亡和促血管生成因子, 能誘導成纖維細胞遷移、增殖及膠原合成。MSC-Exo和有機生物材料聯合應用以促進愈合過程, 是一種治療慢性傷口的新方法。此外, MSC-Exo還可以促進心臟干細胞增殖、遷移以及血管生成, 增加梗死區域毛細血管密度, 減少心肌纖維化, 從而保護心臟功能。

外泌體參與組織修復

3 MSC-Exo通過miRNA調控組織再生

miRNA是非編碼單鏈RNA分子, 由19~25個核苷酸組成, 通過降解目的mRNA或抑制翻譯引起基因沉默, 對細胞分化、增殖、凋亡、遺傳調控及固有免疫和適應性免疫有重要的調控作用。作為一種新型RNA運載工具, 外泌體由于能避免內吞, 而且能快速逃避網狀內皮組織系統細胞的清除, 因而擁有較高的運載效能。

大量研究證實, 外泌體能傳遞miRNA至靶細胞, 發揮促進組織再生作用。從兔脂肪組織中分離MSCs, 提取外泌體, 并給予結膜下和眼內注射12周后, 糖尿病家兔獲得了清晰的視網膜結構。家兔血糖與視網膜組織miRNA-222表達水平呈顯著負相關, MSC-Exo注射后視網膜再生與miRNA-222的表達增加相關。在大鼠心肌梗死模型中, MSC-Exo能夠與MSCs同樣抑制心肌纖維化和炎癥。miRNA序列分析表明, MSC-Exo和MSCs有相似的miRNA表達, 這也是MSC-Exo能夠代替MSCs進行心臟修復的原因之一。另外, 研究還發現一些負向調節心肌功能的miRNA, 如miRNA-130、miRNA-378、miRNA-34相對呈低表達; 而一些正向調節心肌功能的miRNA, 如miRNA-29、miRNA-24相對呈高表達。

miRNA序列分析發現, miRNA-140-5p在SMSC-Exo中呈低表達, 而過表達miRNA-140-5p的SMSC-Exo能夠促進軟骨細胞的增殖和遷移, 而不影響細胞外基質的分泌; miR-140-5p還能通過靶向RalA增強SOX9和聚集蛋白聚糖, 預防大鼠骨關節炎, 在軟骨動態平衡和發育中扮演雙重角色。

另有研究發現, 脂肪干細胞和BMSCs的外泌體miRNA表達譜高度類似, 只有極少部分轉運RNA (transfer RNA, tRNA)略有不同, 推測正是這些不同的tRNA起到了關鍵作用。有關tRNA對外泌體組織再生作用機制的研究可能會成為新的熱點。

4 MSC-Exo通過調節免疫促進組織再生

多種動物模型證明, MSC-Exo能通過局部抗炎作用修復受損組織。在小鼠急性炎癥模型中, 脫落乳牙牙髓干細胞外泌體能抑制炎癥引起的小鼠足部腫脹[25]。在大鼠急性心肌缺血模型中, BMSC-Exo能抑制炎癥反應, 緩解心肌梗死后的纖維化, 促進血管再生, 從而提高缺血損傷后的心肌功能。

BMSC-Exo能有效地修復免疫活性大鼠模型骨軟骨缺損。進一步的機制研究發現, MSC-Exo介導的軟骨修復過程中, 細胞的快速增殖和浸潤是由于外泌體CD73介導的絲氨酸蘇氨酸激酶(?AKT)和細胞外調節蛋白激酶(ERK)信號分子腺苷激活; AKT或ERK磷酸化抑制劑可抑制外泌體介導的細胞增殖和遷移, 但不抑制基質合成; 而應用CD73抑制劑和腺苷受體拮抗劑后可導致AKT和ERK衰減, 進而證實了外泌體CD73的作用。MSC-Exo還能促進M2巨噬細胞浸潤, 減少前炎性細胞因子白細胞介素(?IL)-1B和腫瘤壞死因子-α (TNF-α)分泌。這些均提示MSC-Exo介導的高效骨軟骨再生是通過包括免疫細胞在內的多種細胞的協同動員和激活實現的。

hucMSC-Exo能夠有效促進巨噬細胞從M1向M2表型的極化。體內研究表明, hucMSC-Exo通過下調炎性細胞因子, 如TNF-α、巨噬細胞炎癥蛋白1α (MIP-1α)、IL-6和干擾素γ (IFN-γ), 減輕損傷區的炎癥, 促進脊髓損傷后的功能恢復。

MSC-Exo是多種疾病無細胞治療的新選擇。然而, 移植后隨著時間的推移, 維持體內外泌體的存留和穩定是臨床應用MSC-Exo中的一個重要挑戰。最近有研究發現, 殼聚糖水凝膠能顯著提高人類胎盤MSCs來源外泌體中蛋白質和miRNA的穩定性, 增強外泌體的滯留和穩定性。利用螢火蟲熒光素酶顯像檢測血管生成情況, 結果發現殼聚糖水凝膠外泌體對小鼠后肢缺血具有持久治療作用。該研究所采用的策略有望成為評估及提高MSC-Exo治療效果的一種簡單有效的方法。

綜上所述, MSC-Exo不僅攜帶多種傳遞生物學信息的RNA、DNA和蛋白, 而且能激活多種信號通路, 促進靶器官相關細胞活化、增殖, 修復損傷, 達到組織再生的目的。而且, MSC-Exo具有穩定、低免疫原性等優點, 因此已成為以無細胞為基礎的、更優秀的組織再生生物治療的新選擇。