富血小板血漿（PRP）通過在人骨關節炎軟骨中增加細胞自噬、抗炎標志物、以及降低凋亡而起作用

細胞自噬構成了一個防御性的機制，以克服骨關節炎軟骨的老化和凋亡。一些與細胞自噬相關的細胞因子和轉錄因子在骨關節炎中的退行性病變級聯反應中發揮了重要作用。注入富血小板血漿（PRP）相關的細胞療法近期涌現出來，作為包括OA在內很多疾病的有富有前景的療法。但是，PRP改善軟骨修復的主要作用機制仍然未知。本研究的目的是調查PRP對軟骨再生的效果，并且闡明PRP促進軟骨再生的機制。

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本研究將骨關節炎軟骨細胞與從健康供體中獲得的增加了濃度的PRP進行共培養。應用WST8增殖檢測和細胞計數法評估PRP對軟骨增殖的影響。應用流式細胞儀分析去確定細胞自噬、凋亡和細胞間IL-4、IL-10和IL13水平。同時使用定量聚合酶鏈式反應（qPCR）方法確定細胞自噬標記物BECLIN和LC3II的表達水平。qPCR和ELISA被用來測定組織中和共培養媒介中的ADAMDTS-5、MMP3、MMP13、TIMP-1-2-3、aggregan、二型Collagen、TGF-β, Cox-2, Il-6, FOXO1, FOXO3, 和HIF-1.

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研究結果發現，PRP顯著提升了骨關節炎軟骨細胞中的軟骨細胞增殖，降低了凋亡，并且增加了細胞自噬及其標志物、以及調節子FOXO1?FOXO3和HIF-1的表達。而且，PRP導致了MMP3, MMP13, and ADAMTS-5, IL-6 和COX-2等的劑量反應的顯著降低，而增加TGF-β, aggregan、collagen type 2, TIMPs 和?intracellular IL-4, IL-10, IL-13等.

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本研究的結果表明PRP可能是治療OA的潛在治療工具。

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表1：實時PCR引物序列列表。

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圖1：PRP對軟骨細胞增殖的影響。將105個軟骨細胞接種于6個孔板中，分別加入或不加入不同濃度的PRP(5%、10%和20%)，培養48 h。(A)顯微鏡下觀察，PRP處理軟骨細胞形態正常，細胞數量增加。(B)通過細胞計數法和(C) WST-8增殖試驗評估軟骨細胞的增殖。兩項試驗均顯示軟骨細胞增殖率顯著增加。數據代表了五個獨立的實驗。數據以平均值±SD表示。組間差異顯著*P ?0.05, * * P ?0.005 * * * P ?0.001。

圖2：增加PRP濃度對軟骨細胞自噬的影響。通過不同的方法評估自噬:A) Giemsa染色顯示空泡形成的劑量依賴性增加;(B)自噬體檢測反應后的流式細胞術顯示自噬體形成增加。Real – time PCR實驗顯示，隨著PRP劑量的增加，(C) BECLIN和(D) LC3II mRNA水平顯著升高。在(E) FOXO1, FOXO3和(F) HIF-1對增加PRP劑量的反應中也觀察到類似的結果。數據代表了五個獨立的實驗。數據以平均值±SD表示。組間差異顯著*P ?0.05, * * P ?0.005 * * * P ?0.001。

圖3：PRP對軟骨細胞靜止的影響。用碘化丙啶(PI)法測定不同濃度PRP處理軟骨細胞的細胞死亡水平。染色顯示，靜息細胞百分比呈劑量依賴性增加。數據代表了五個獨立的實驗。數據以平均值±SD表示。

圖4：PRP對軟骨細胞死亡的影響。(A) Annexin V/PI流式細胞術分析顯示細胞死亡率下降。減少率是通過從對照中減去這個值來計算的。(B) Dapi染色顯示藍色熒光相對于PRP濃度的增加而下降。(C) real time PCR顯示BCL2 mRNA水平升高，BAD和Caspace-3 mRNA水平下降。結果顯示為對照的百分比。數據代表五個獨立實驗的平均值±標準差。組間差異顯著*P ??0.05, * * P ?0.005 * * * P ?0.001。

圖5：PRP對TGFβ、IL-6、COX2表達的影響實時熒光定量PCR檢測OA供體OA軟骨組織中TGFβ、IL-6和COX2的表達。數值代表了8個獨立實驗。數據以平均值±SD表示。組間差異顯著*P ??0.05, * * P ?0.005 * * * P ?0.001。

圖6：細胞內白介素IL-4、IL-10和IL-13表達的流式細胞術分析顯示，隨著PRP濃度的增加，細胞內IL-10 (A)、IL-13 (B)和IL-4 (C)水平升高。數值代表了三個獨立的實驗。數據以平均值±SD表示。

圖7：PRP對金屬蛋白酶、組織抑制劑金屬蛋白酶表達及細胞外基質成分的影響。(A-C)通過定量PCR分析MMPs、ADAMTS-5和TIMPs的mRNA水平。(B-D)用Elisa法測定經PRP處理的軟骨細胞上清液的蛋白水平。(E)定量PCR分析AGG和COL2A1的表達。數值代表了8個獨立實驗。數據以平均值±SD表示。組間差異顯著*P ?0.05, * * P ?0.005 * * * P ?0.001。

參考文獻：Moussa M , ?D ?Lajeunesse, ?Hilal G , et al. Platelet rich plasma (PRP) induces chondroprotection via increasing autophagy, anti-inflammatory markers, and decreasing apoptosis in human osteoarthritic cartilage[J]. Experimental Cell Research, 2017, 352(1):146-156.