行則將至：iPSC細(xì)胞療法在日本的臨床研究

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角膜之所以維持透明，它表面的上皮細(xì)胞功不可沒。我們?nèi)祟惖慕悄ど掀ぜ?xì)胞不斷生長，不斷更新，而維持這種更新的源泉就是角膜緣干細(xì)胞。當(dāng)角膜緣干細(xì)胞缺乏時(shí)（即角膜緣干細(xì)胞缺乏癥，limbal stem cell deficiency，LSCD），會(huì)導(dǎo)致角膜上皮持續(xù)性缺損，角膜血管化、角膜潰瘍感染、不透明，嚴(yán)重者造成角膜穿孔、甚至危及整個(gè)眼球，導(dǎo)致失明。供體角膜移植已被用于治療可能導(dǎo)致失明的嚴(yán)重角膜上皮疾病，但也存在排斥反應(yīng)和供體短缺的問題。

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日本大阪大學(xué)的眼科醫(yī)師 Koji Nishida（西田幸二）團(tuán)隊(duì)利用iPSC來源的角膜細(xì)胞組織層來修復(fù)損傷的角膜。研究小組開發(fā)了一種二維培養(yǎng)系統(tǒng)“SEAM方法”，通過促進(jìn)iPS細(xì)胞自分化來組織重建所有的眼樣結(jié)構(gòu)。這個(gè)細(xì)胞薄片構(gòu)成眼睛的主要細(xì)胞群（包含角膜上皮、視網(wǎng)膜和晶狀體上皮）出現(xiàn)在組織的特定區(qū)域。研究小組從二維組織結(jié)構(gòu)中分離出了角膜上皮祖細(xì)胞，并成功地產(chǎn)生了功能性的角膜上皮組織。

?iPSC治療角膜緣缺乏癥示意圖?

研究小組通過將人類iPSC制備的角膜上皮組織移植到動(dòng)物模型中，證明了治療效果。在2019年7月至2020年12月，這個(gè)研究小組把用iPSC制作的厚度0.05毫米薄膜狀角膜組織，移植給幾乎喪失視力的“角膜緣干細(xì)胞缺乏癥”的4名患者的全球首例臨床研究已完成。

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此后經(jīng)過1年的隨訪觀察，未發(fā)生排異反應(yīng)和癌變等問題，確認(rèn)了安全性。全部患者癥狀均有改善，其中3人的矯正視力提高，有患者從0.15升至0.7。

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大多數(shù)哺乳動(dòng)物，大腦在胚胎時(shí)期就已經(jīng)完成大部分，只有一小部分神經(jīng)在出生后持續(xù)發(fā)展。神經(jīng)損傷引起的疾病將導(dǎo)致永久性的殘疾，如何利用iPSC來修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)是目前干細(xì)胞療法的熱門研究。

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人們發(fā)現(xiàn)利用iPSC分化的多巴胺能神經(jīng)元可以治療帕金森病。帕金森病是大腦黑質(zhì)區(qū)（subatantia nigra）分泌多巴胺的神經(jīng)細(xì)胞退化造成的一種疾病。帕金森病僅次于阿爾茨海默病，是第二常見的神經(jīng)退行性疾病。在美國，男性的終生風(fēng)險(xiǎn)為2%，女性為1.3%。

日本京都大學(xué)iPS細(xì)胞研究所JunTakahashi（高橋淳，也就是高橋政黛的丈夫）研究小組于2018年8月開展使用iPSC來源的多巴胺神經(jīng)祖細(xì)胞治療帕金森病的臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)移植的細(xì)胞來自HLA-homo iPS 細(xì)胞庫。種子細(xì)胞iPSC經(jīng)過誘導(dǎo)分化，并通過流式細(xì)胞儀分選純化出corin陽性的細(xì)胞（corin是多巴胺神經(jīng)祖細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物）。研究小組將與HLA匹配后的異體iPSC誘導(dǎo)分化為多巴胺神經(jīng)祖細(xì)胞，配合低量免疫抑制劑，通過定位腦手術(shù)將大約500萬個(gè)分化的細(xì)胞移植到患者大腦紋狀體左右兩側(cè)皮質(zhì)部分。

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在臨床試驗(yàn)之前，先證實(shí)了移植的人類iPSC來源的多巴胺神經(jīng)祖細(xì)胞在帕金森病的食蟹猴模型中的有效性和安全性。經(jīng)過兩年的跟蹤，沒有觀察到猴子腫瘤的形成，也沒有發(fā)現(xiàn)任何惡性轉(zhuǎn)化的證據(jù)，確認(rèn)了安全性。結(jié)果顯示：移植的猴子運(yùn)動(dòng)活動(dòng)增加，帕金森病癥狀有所改善。PET分析顯示，移植的細(xì)胞在大腦中合成了多巴胺。

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脊髓損傷（Spinal cord injury），通常指脊髓受到外部影響，造成損傷部位及其以下部分癱瘓或全部癱瘓，使患者終身殘疾。脊髓損傷是一種比較常見的外傷。脊髓損傷治療的難點(diǎn)在于神經(jīng)傳導(dǎo)重建及運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。

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日本慶應(yīng)大學(xué)生理學(xué)?Hideyuki Okano（岡野榮之）研究小組于2019年2月被批準(zhǔn)開展使用采用iPSC來源神經(jīng)祖細(xì)胞治療亞急性期脊髓損傷的臨床研究。但由于COVID-19疫情原因，研究被延后至2021年年底才得以開展。臨床試驗(yàn)移植的細(xì)胞來自HLA-homo iPS細(xì)胞庫。臨床試驗(yàn)選擇的適應(yīng)癥，為亞急性脊髓損傷（C3/4-Th10水平，損傷后14-28天內(nèi)），共納入4名受試患者。試驗(yàn)的主要目的是評(píng)估hiPSC-NS/PC移植細(xì)胞和移植方法的安全性。次要目標(biāo)是獲得其對(duì)神經(jīng)功能和生活質(zhì)量影響的初步證據(jù)。

iPSC治療脊髓損傷的臨床概要

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心力衰竭（heart failure）簡稱心衰，是由于心臟泵血力量不足導(dǎo)致的一種心臟疾病。缺血性心臟病是由于冠狀動(dòng)脈阻塞引起心肌組織慢性缺血，從而導(dǎo)致功能性心肌細(xì)胞壞死。然而，成熟的心肌細(xì)胞是不能自我更新的，缺血和壞死區(qū)域的心肌逐漸被纖維組織所取代。因此，補(bǔ)充功能性心肌細(xì)胞是延緩心衰進(jìn)程的一種合理方法。因?yàn)樾募〖?xì)胞沒有增殖能力，難以大量產(chǎn)生。因此，骨骼肌細(xì)胞、骨髓單個(gè)核細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）都是候選細(xì)胞，被用于替代心肌細(xì)胞，并進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)。

起初，細(xì)胞片由自體骨骼肌細(xì)胞制造的，可以直接貼到心臟表面。治療機(jī)制主要依靠細(xì)胞片旁分泌的營養(yǎng)因子和細(xì)胞片細(xì)胞與宿主心肌融合。然而，因?yàn)槭亲泽w個(gè)性化移植，缺點(diǎn)很明顯：一是患者需要等待時(shí)間長，二是制作成本較高。因此，開發(fā)一種通用型標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)貨性產(chǎn)品，尤為重要。細(xì)胞薄片，便是這樣一種產(chǎn)品，通過HLA配型后的iPSC衍生的心肌細(xì)胞薄片，可當(dāng)做通用型產(chǎn)品。

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在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，研究發(fā)現(xiàn)人類胚胎干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞在組織學(xué)上和電生理學(xué)上都能與宿主心肌匹配結(jié)合，這與以前移植的非心肌細(xì)胞不同。在猴子實(shí)驗(yàn)，也顯示了其生存能力和功能的改善。在猴子心肌梗死模型中，HLA匹配的猴子iPSC來源的心肌細(xì)胞即使在移植后12周仍能存活，并產(chǎn)生宿主心臟的功能改善。然而，在所有的猴子中都觀察到一些室性心律失常，這表明處理移植前的心律失常的影響是必要的。

在日本，HEARTSHEET??的發(fā)明者之一，大阪大學(xué)的外科醫(yī)生?Yoshiki Sawa教授通過 iPSC制成心肌細(xì)胞薄片，用于治療豬的心力衰竭。研究小組研究了心臟功能改善的機(jī)制，包括分析了iPSC來源的心肌細(xì)胞的旁分泌因子。研究小組通過HLA-homo iPS 細(xì)胞成功制備了大量高度安全的心肌細(xì)胞薄片，可以用于人體移植。目前，研究小組正在進(jìn)行一項(xiàng)臨床試驗(yàn)，以驗(yàn)證心肌細(xì)胞薄片治療心力衰竭的安全性和有效性（jRCT2053190081）。臨床適應(yīng)癥是缺血性心臟病，招募10個(gè)病人。

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在日本，每年臨床需要超過170萬升血小板，主要獻(xiàn)血者捐贈(zèng)。尷尬的是，血小板在采血后只能保存4天。由于新生兒出生率下降和人口老齡化，獻(xiàn)血者群體的數(shù)量正在減少，但需要血小板的老年人群體數(shù)量正在增加。未來，不僅是血小板制劑，而且輸血制劑也可能出現(xiàn)供應(yīng)不足的情況。

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通常，再生障礙性貧血（即“再障”）或其他疾病造成的嚴(yán)重血小板減少，需要進(jìn)行血小板輸血。然而，輸血可能會(huì)引起血小板輸血頑固可能發(fā)生，即輸血后血液中的血小板不會(huì)升高。其主要原因是外來的血小板被患者自身免疫細(xì)胞破壞。在這種情況下，血小板不能通過異基因血小板輸血來補(bǔ)充。如果血小板是由自體細(xì)胞制造的，輸血就不會(huì)發(fā)生免疫反應(yīng)。

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日本京都大學(xué)iPS細(xì)胞研究所（CiRA）教授 Koji ?Eto，利用生物反應(yīng)器從iPSC中制造出大量血小板，并開展再生障礙性貧血合并血小板輸血頑固性的臨床研究。臨床試驗(yàn)?zāi)康氖菣z測血小板制劑的安全性。單劑量遞增研究，輸血后隨訪一年。血小板治療的過程：采集患者細(xì)胞，制備成iPS細(xì)胞。接著，再把iPS細(xì)胞制備成造血祖細(xì)胞，再分化成巨核細(xì)胞，并冷凍作為主細(xì)胞庫，巨核細(xì)胞可以長時(shí)間儲(chǔ)存。最后，由巨核細(xì)胞制備血小板。需要注意的是，血小板分離、濃縮和清洗后，需要通過照射根除殘留的巨核細(xì)胞。

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近年來，癌癥免疫治療作為手術(shù)治療、化療（抗癌藥物和激素給藥）和放療后的重要治療選擇，越來越到關(guān)注。

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NKT細(xì)胞（自然殺傷T細(xì)胞）是一類兼具NK細(xì)胞和T細(xì)胞部分表型和功能的細(xì)胞亞群，通過識(shí)別CD1d上的MHC-I激活。被激活的NKT細(xì)胞，通過產(chǎn)生穿孔素等表現(xiàn)出直接的細(xì)胞毒活性。同時(shí)，也產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子（如IFN-γ），誘導(dǎo)激活NK細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤作用。

作為一種治療頭頸癌的新療法，Haruhiko Koseki 和 Shin-Ichiro Fujii 研究組正在進(jìn)行一項(xiàng)使用iPSC衍生的NKT細(xì)胞的臨床試驗(yàn)（jRCT2033200116）。iPSC衍生的NKT細(xì)胞治療的過程：首先，將異體iPSC誘導(dǎo)成NKT細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，然后將約 3X10*8 個(gè)制備的NKT細(xì)胞，注入已接受現(xiàn)有患者的腫瘤部位血管內(nèi)。根據(jù)輸入后不良反應(yīng)等情況及時(shí)調(diào)整劑量，共計(jì)回輸3次。隨訪2年，確認(rèn)安全性和有效性。

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骨關(guān)節(jié)炎是世界上最常見的關(guān)節(jié)疾病，在60歲以上人群中，10%的男性和18%的女性都受其影響。

日本京都大學(xué)iPS細(xì)胞研究所（CiRA）Noriyuki Tsumaki教授開展使用iPSC來源的軟骨移植治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的臨床試驗(yàn)（jRCTa050190104）。研究團(tuán)隊(duì)已成功制備出了iPSC來源的高質(zhì)量軟骨。先前動(dòng)物研究證實(shí)，iPSC來源的軟骨不會(huì)產(chǎn)生腫瘤，并在移植區(qū)可以再生軟骨。

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臨床研究目的是評(píng)價(jià)軟骨損傷患者實(shí)施細(xì)胞移植后的安全性。主要終點(diǎn)事件是不良事件發(fā)生的頻率和是否腫瘤發(fā)生。為了制備軟骨，軟骨細(xì)胞從來自HLA-homo iPS 細(xì)胞庫里的iPSC誘導(dǎo)，軟骨組織由軟骨細(xì)胞產(chǎn)生。研究人員的目標(biāo)是在未來用這種療法來治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎。

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在臨床研究中，研究者對(duì)患者實(shí)施單側(cè)膝關(guān)節(jié)腔細(xì)胞移植，參與臨床試驗(yàn)的患者4例，年齡在20-70歲，軟骨部分損傷。關(guān)節(jié)鏡下實(shí)施細(xì)胞移植修復(fù)軟骨缺損。患者術(shù)后恢復(fù)6周。隨訪1年，觀察軟骨再生和修復(fù)情況。

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尿素循環(huán)障礙是指當(dāng)尿素循環(huán)中某一種酶有先天性缺陷時(shí)，氨合成尿素發(fā)生障礙，游離的氨蓄積體內(nèi)，形成高氨血癥，臨床上表現(xiàn)為嚴(yán)重的腦功能障礙。這個(gè)過程發(fā)生在肝臟細(xì)胞中。

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傳統(tǒng)的治療手段需要進(jìn)行肝臟移植，但出于安全考慮，日本規(guī)定只有在患兒體重達(dá)到6kg（一般出生3~5月以上）后才能進(jìn)行移植。為了給后續(xù)的肝移植打下基礎(chǔ)，需要在肝移植之前需要進(jìn)行“橋梁治療”。在日本，由于沒有來自捐贈(zèng)肝移植供體的肝細(xì)胞，最大挑戰(zhàn)是確保質(zhì)量一致的肝細(xì)胞作為肝細(xì)胞移植的穩(wěn)定供應(yīng)來源。

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日本國立成育醫(yī)療研究中心 Akihiro??Umezawa?研究小組專注于制備人胚胎干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞（JMA-IIA00412），建立了人類胚胎干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞庫，長期低溫保存，能夠適應(yīng)緊急使用。

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臨床研究中，在一名患有“尿氨酸血癥1型”的尿素循環(huán)異常癥的患兒出生的第六天，研究小組分兩次在腹部注射了1.9X10*8個(gè)胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化來的肝細(xì)胞，用以提高肝臟的解毒功能。給藥完成后，沒有任何與移植過程相關(guān)的并發(fā)癥或不良事件。患兒進(jìn)行胚胎干細(xì)胞治療后，大概6個(gè)月左右就接受了來自父親的活體肝移植。同時(shí)，醫(yī)院給患兒使用免疫抑制劑，避免了患兒產(chǎn)生排異反應(yīng)。術(shù)后第二個(gè)月，患兒就出院了。患兒的移植很成功，病情穩(wěn)定。這是日本國內(nèi)首次使用胚胎干細(xì)胞治療人體疾病，也是世界首例使用胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)肝細(xì)胞的移植手術(shù)。

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慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）是指各種腎臟疾病引起的緩慢進(jìn)行性腎功能損害，最后導(dǎo)致尿毒癥和腎功能完全喪失。由于捐獻(xiàn)的腎源有限，絕大部分腎功能衰竭患者都只能依賴透析。在日本，大約有33萬名透析患者，其中約有7000人已經(jīng)接受透析治療超過30年。

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腎移植是一種恢復(fù)腎功能的治療方法，是終末期腎衰竭患者透析的替代方法。腎臟移植主要有尸體腎移植和活體供腎移植。在日本，來自捐贈(zèng)者的腎移植比較少。日本每年進(jìn)行腎移植的數(shù)量被限制在約1700例左右。比起美國每年進(jìn)行的2萬多例，相差甚遠(yuǎn)。因此，治療腎臟疾病的再生醫(yī)學(xué)正在被熱切地期待之中。

?種間腎臟再生技術(shù)圖示

研究小組將的iPSC誘導(dǎo)分化為腎元祖細(xì)胞 (nephron progenitor cells, NPCs)，體外培育成腎芽后再移植給正在接受人工透析治療的腎衰竭患者。先使用來自HLA-homo iPS 細(xì)胞庫的腎元祖細(xì)胞，培育成腎芽，再分化誘導(dǎo)刺激形成腎小球和腎小管。由于腎臟被一層薄薄的膠囊覆蓋，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，研究團(tuán)隊(duì)將iPSC來源的NPCs注入腎實(shí)質(zhì)和囊之間的空間，對(duì)缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的急性腎衰竭小鼠模型有治療作用。

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我們概述了日本使用基于iPSC進(jìn)行的臨床試驗(yàn)。雖然iPSC仍然面臨諸多挑戰(zhàn)，但仍不能阻擋其在細(xì)胞治療和其他應(yīng)用方面的巨大潛力。大量的科學(xué)家仍然持續(xù)在這一領(lǐng)域進(jìn)行努力耕耘，不斷克服剩余的障礙。

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近年來，國內(nèi)基于iPSC治療的企業(yè)也如雨后春筍般興起，紛紛申請(qǐng)開展IND或IIT，開始各種嘗試，探索中國的iPSC治療。在不久的將來，基于iPSC的細(xì)胞治療技術(shù)將成為一項(xiàng)真正的臨床選擇，在全球范圍內(nèi)為病人帶來福音。

參考資料：