一文解釋清楚輸入的間充質干細胞在人體中的宿命

介紹一篇文章，雖然發表于2009年的《stem cells》雜志，但是至今沒見到同類的文章能超越這篇文章。

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這篇文章的核心：即為小鼠骨髓間充質干細胞（MSC）在抑制免疫反應的同時，能被免疫系統所清除，同時引發免疫記憶，從而加速后續輸入MSC的清除速度；生物學遺傳背景相差越遠，則清除速度越快；因此證明了MSC并不是通過分化來發揮治療作用。

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【文章詳解】

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【結果】

1，MSC的鑒定和成纖維細胞的比較

經過CD11b陰性選擇純化的MSC，能成脂和成骨分化，100%表達CD29、87%表達Sca-1、62%表達CD44、53%表達CD49e和24%表達MHC-I類抗原。而成纖維細胞只能成脂分化，89%表達CD29、4%表達Sca-1、6%表達CD44、99%表達CD49e和46%表達MHC-I類抗原。【注：小鼠MSC和大鼠MSC的鑒定一直沒有全球化的統一標準。從本文的指標結果來看，MSC雖然經過CD11b的分析，但是純度依然不夠，比如CD44達不到95%以上。】

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2，MSC的免疫抑制研究

（1）體外細胞實驗

分別利用特異性抗原刺激CD4+T細胞和CD8+T細胞增殖。在MSC和T細胞的比例為1：4時，MSC抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞增殖的抑制率分別為87%和76%。當提高MSC的數量到1：2時，MSC抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞增殖的抑制率超過90%。而成纖維細胞無法有效地抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞的增殖。

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（2）骨髓移植實驗

【點評】：本文的免疫抑制實驗闡述了3點：即MSC的抑制T細胞激活增殖的效率呈劑量依賴性；MSC的免疫抑制作用沒有種屬限制性和沒有MHC限制性；這兩個MSC劑量（2×10⁶/每只和4×10⁶/每只）對于本實驗用的小鼠沒有療效上的差異。另外，如果提高或者降低MSC的劑量，是否對療效產生足夠明顯的影響？

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3，MSC進入體內后的免疫原性實驗

（1）異體MSC腹腔注射后的存活時間

在免疫系統健全的小鼠（Balb/c）體內，MSC在腹腔存在的時間明顯縮短，而成纖維細胞的存在時間更短，只有10來天。但是，在免疫缺陷的小鼠（Nude小鼠和NOD/SCID小鼠）體內，MSC和成纖維細胞的存在時間明顯延長，可以超過120天。從熒光強度來看，MSC存在的數量超過相同時間點的成纖維細胞。

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（2）MSC靜脈注射后的存活時間

MSC靜脈注射后，在體內的MSC信號在第20天開始減少。異體MSC的信號在第40天時完全消除，異體成纖維細胞在第15天時完全被清除。相比之下，這兩種細胞類型在同基因受體中存活均超過40天。

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（3）成纖維細胞和MSC誘導免疫記憶

裸鼠（Nude小鼠）和Balb/c小鼠接受2次的異體Luc+細胞注射，相隔30天。第1次注射Luc+成纖維細胞的信號只能存在14天，而第2次的異體成纖維細胞在第二天即被排斥清除。有意思的是，即使第1次注射的是Luc+MSC，亦能誘導免疫細胞對成纖維細胞的記憶，從而加速第2次注射的Luc+成纖維細胞的清除。【注：這個實驗現象與MSC誘導免疫抑制的現象剛好相反。】

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TCR轉基因2C和TEA小鼠接受2次的分別來源于CB6/F1小鼠和SJL小鼠的骨髓MSC注射，每次注射相隔40天。TEA-CD4+和2C-CD8+細胞只能通過其MHC分子識別CB6/F1小鼠的細胞，而SJL來源的骨髓MSC則不能被這些轉基因小鼠T細胞的TCR轉基因識別。在第一次注射MSC的55天后，在小鼠脾臟中流式分選CD4+T細胞和CD8+T細胞，流式檢測記憶性T細胞表面標記物。在接受CB6/F1小鼠骨髓MSC注射后，TEA轉基因小鼠脾臟中記憶性CD4+T細胞增加到41%，而接受SJL小鼠骨髓MSC注射后，TEA轉基因小鼠脾臟中記憶性CD4+T細胞只增加到7%。相似，在接受CB6/F1小鼠骨髓MSC注射后，2C轉基因小鼠脾臟中記憶性CD8+T細胞增加到26.5%，而接受SJL小鼠骨髓MSC注射后，TEA轉基因小鼠脾臟中記憶性CD8+T細胞只增加到0.6%。【注：這個實驗現象提示不同品系小鼠的骨髓MSC引起免疫記憶的程度不同。CB6/F1小鼠是雌性Balb/c和雄性C57BL/6雜交的第一代動物，SJL小鼠是三種品系的Swiss Webster小鼠雜交后經過近交培育而成。TCR轉基因2C和TEA小鼠是FVB遺傳背景，Swiss Webster小鼠雜交而來。】

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【點評】：MSC的體內檢測實驗闡述了3點：MSC進入體內后被免疫系統所清除，免疫系統功能越健全，MSC在體內的清除速率就越快；局部注射MSC能延長MSC在體內的存在時間，而靜脈注射MSC更容易被機體免疫系統所清除；遺傳背景差異越大的MSC，越能引起免疫記憶，從而加速后續進入體內的MSC的清除。

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【材料和方法】

1，動物：6-12周齡的小鼠，品系為CB6/F1、FVB、轉基因Luc+ FVB（FVB/N-L2G85）、SJL、C3H/HeJ、Balb-Nude、Balb-SCID、轉基因H-2^b小鼠。

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2，細胞：小鼠骨髓MSC、小鼠皮膚成纖維細胞、小鼠CD4+T細胞、小鼠CD8+T細胞。

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3，MSC的培養：IMEM、10%FCS、1%維生素、1%非必需氨基酸、2%谷氨酰胺、1%雙抗。原代培養14天后，磁珠分選去除CD11b陽性的細胞。

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4，MSC的鑒定：成脂分化和成骨分化、細胞表面標記物：SCA-1、MHC-I（H2L^d）、CD11b、CD29、CD49e、CD44、Vα2/Vβ6。

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5，混合淋巴細胞反應（MLR）：效應細胞為轉基因2C或TEAH-2^b小鼠的脾細胞，刺激細胞為經過20Gy照射的CB6/F1小鼠脾細胞，抗原為H-2Ld或I-Ab，流式（FACS）檢測效應T細胞的增殖。

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6，T細胞介導的骨髓移植排斥實驗：對C3H/HeJ小鼠進行照射（10 Gy），第二天注射純化的1.5萬個宿主T細胞重建。這些C3H/HeJ小鼠接受移植4×10⁶個異基因（不含T細胞）CB6/F1的骨髓細胞，以及來自不同基因型（CB6/F1或FVB）或Fib（FVB供體類型）的不同劑量的MSC，MSC的劑量為每只小鼠（2-4）x10⁶個細胞。每天監測小鼠的存活情況。

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7，IVIS系統檢測Luc+細胞的成像：FVB、Balb/c、Balb-Nude、Balb-SCID小鼠分布通過腹腔或靜脈注射FVB小鼠來源的Luc+MSC或Luc+Fib（Fib即為成纖維細胞），觀察周期最長為120天。

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8，轉基因2C或TEA小鼠的記憶性淋巴細胞的檢測：轉基因2C或TEA小鼠接受CB6/F1小鼠和SJL小鼠的骨髓MSC注射2次，每次注射相隔40天。在第一次注射MSC的55天后，在小鼠脾臟中流式分選CD4+T細胞和CD8+T細胞，流式檢測記憶性T細胞表面標記物。

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理性看待研究性文章結果，懷著科學的態度，合理質疑或接受，同時需要考慮到不同的實驗條件對實驗結果的影響程度。本篇文章還是屬于現象的研究，從免疫反應的角度去初步探討影響MSC在體內存留時間的因素。很多研究已經明確了MSC進入體內后，由于免疫系統的存在，MSC并不能長期存活，沒有足夠的時間去分化為組織特異的細胞，所以MSC發揮治療作用的機制不是分化。