【學(xué)術(shù)前沿】鄒衛(wèi)國/羅卓荊團(tuán)隊(duì)鑒定和應(yīng)用髓核前體細(xì)胞治療椎間盤退變

2022年2月23日，國際學(xué)術(shù)期刊Advanced Science在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）鄒衛(wèi)國研究組與空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科羅卓荊教授團(tuán)隊(duì)的最新研究成果Discovery and Application of Postnatal Nucleus Pulposus Progenitors Essential for Intervertebral Disc Homeostasis and Degeneration。

隨著生活節(jié)奏的加快，椎間盤退變（IDD）所導(dǎo)致的頸肩、腰背痛是當(dāng)前社會(huì)最常見的退行性疾病，不僅帶來了巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也對飛行員、航天員等經(jīng)歷高負(fù)載作業(yè)的特殊職業(yè)人群的服役時(shí)間和工作狀態(tài)產(chǎn)生嚴(yán)重影響【1】。IDD是指髓核、纖維環(huán)及軟骨終板等椎間盤組成的病理性退變，它是一系列脊柱退行性疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ)。該研究首次通過模式動(dòng)物篩選出純化的椎間盤髓核組織（Nucleus Pulposus，NP）進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析，定義了四個(gè)不同功能性的髓核細(xì)胞亞群，并通過譜系示蹤的方法首次鑒定出小鼠成體期髓核前體/祖細(xì)胞的存在–urotensin II receptor+ NP Progenitors（UTS2R+ ProNPs），其高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物，具有克隆形成及三系分化的能力，并且在小鼠椎間盤退變模型及臨床椎間盤退變臨床病人組織樣本中數(shù)量顯著減少。該研究還發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白Tenascin-C作為UTS2R+ProNPs的潛在特異性微環(huán)境維持因子，對UTS2R+ProNPs功能維持與延緩椎間盤退變方面起到重要作用。

目前椎間盤退變導(dǎo)致的臨床癥狀主要通過保守治療和手術(shù)治療緩解，保守治療主要依靠抗炎、肌肉松弛劑和神經(jīng)營養(yǎng)藥物等來緩解疼痛或炎癥，脊柱融合術(shù)、人工椎間盤置換等手術(shù)治療也不能恢復(fù)椎間盤的正常生理功能，甚至導(dǎo)致脊柱的異常受力而產(chǎn)生不良后果【2】。因此，開發(fā)新的椎間盤退變治療策略至關(guān)重要。近幾十年來，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞作為“種子”的細(xì)胞療法取得了很大進(jìn)展，這些細(xì)胞已被證明可以減緩IDD進(jìn)程并促進(jìn)ECM重塑。然而，椎間盤組織高滲透壓，壓力過度負(fù)荷、營養(yǎng)缺乏、缺氧的惡劣微環(huán)境對于外源性細(xì)胞很不友好，細(xì)胞療法受到很大挑戰(zhàn)【3-5】。因此，能夠適應(yīng)椎間盤惡劣微環(huán)境的、椎間盤自身的干/前體細(xì)胞可能是最合適的細(xì)胞來源。

椎間盤的穩(wěn)態(tài)在很大程度上依賴于髓核細(xì)胞的功能與狀態(tài)，特別是髓核細(xì)胞數(shù)目與功能的維持和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，既往研究也表明髓核細(xì)胞功能障礙和脊索細(xì)胞耗竭是觸發(fā)IDD發(fā)病和進(jìn)展的主要原因【3-5】。髓核在教科書中一直被認(rèn)為是由性質(zhì)均一的細(xì)胞所組成，但是近年來多種測序技術(shù)和譜系追蹤的結(jié)果證明髓核細(xì)胞可能具有異質(zhì)性。研究者在之前的工作中通過譜系示蹤的手段證實(shí)了小鼠髓核細(xì)胞的異質(zhì)性【6】。另一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)Tie2+GD2+髓核細(xì)胞具有自我更新潛能的干細(xì)胞特性【7】。然而，由于缺乏已建立的標(biāo)記物(特別是膜蛋白)來識(shí)別、篩選以及調(diào)控這些細(xì)胞，髓核前體/祖細(xì)胞的命運(yùn)轉(zhuǎn)歸與功能尚不明確。此外， NP、AF和CEP鄰近的解剖位置使得在不受附近其他細(xì)胞污染的情況下單獨(dú)分析NP細(xì)胞非常困難。這些問題不可避免地影響業(yè)界學(xué)者探索椎間盤穩(wěn)態(tài)維持及退變發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

既往研究表明Shh能夠在椎間盤組織中特異性的標(biāo)記髓核細(xì)胞，在該研究中作者利用Shh-Cre;TdTomato工具鼠也證明了Shh標(biāo)記NP細(xì)胞的特異性，并通過流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)將小鼠髓核細(xì)胞分選出來后進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。測序結(jié)果顯示，小鼠髓核細(xì)胞能夠分為四大類群，其中包括UTS2R+ ProNPs，BMP7+ RegNPs，GDF5+ HomNPs和一個(gè)過渡態(tài)的中間群。

作者重點(diǎn)對UTS2R+ ProNPs細(xì)胞類群進(jìn)行了深入研究，構(gòu)建了誘導(dǎo)型敲除的Uts2r-CreERT2;TdToamto小鼠，通過譜系示蹤發(fā)現(xiàn)，UTS2R標(biāo)記的ProNPs能夠隨著分析年齡的增長而數(shù)目增加，并且能夠增殖并且分化成BMP7+ RegNP及GDF5+ RegNPs，首次在體證實(shí)了成體期髓核前體/祖細(xì)胞的存在。

此外，作者通過流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，UTS2R+ProNPs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞等相關(guān)標(biāo)志物CD44, CD90, CD73, CD105等，并且流式分選后體外培養(yǎng)的UTS2R+ ProNPs具有克隆形成能力，并且可以向成骨、成軟骨和成脂進(jìn)行三系分化，進(jìn)一步證明了UTS2R+ ProNPs作為髓核前體/祖細(xì)胞的增殖和分化能力。

鑒于髓核前體/祖細(xì)胞的耗竭是誘發(fā)IDD發(fā)生發(fā)展的重要因素，作者在小鼠椎間盤退變模型中檢測了UTS2R+ ProNPs的數(shù)目變化，發(fā)現(xiàn)UTS2R+ProNPs明顯減少。在IDD臨床病人組織樣本中，通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，隨著椎間盤退變嚴(yán)重程度的增加，UTS2R+ ProNPs的數(shù)目也相對減少。這提示了在椎間盤退變的過程中伴隨著UTS2R+ ProNPs的耗竭。作者接下來建立了針刺損傷的IDD模型，并在損傷后移植UTS2R+ ProNPs，通過X-ray分析椎間盤高度和Safranin O組化分析，發(fā)現(xiàn)UTS2R+ ProNPs能夠有效緩解IDD進(jìn)程。

基于單細(xì)胞測序結(jié)果，作者還發(fā)現(xiàn)UTS2R+ ProNPs特異性分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白Tenascin-C構(gòu)成自身潛在的細(xì)胞外微環(huán)境，參與維持ProNPs的黏附及活性。在針刺損傷的IDD模型，通過共同移植UTS2R+ProNPs和Tenascin-C能夠最大程度的緩解IDD的進(jìn)程。

該研究首次鑒定出小鼠成體期髓核細(xì)胞存在前體/祖細(xì)胞亞群并在體示蹤其分化譜系，擴(kuò)充了椎間盤穩(wěn)態(tài)維持及退行性變的細(xì)胞學(xué)機(jī)理，并為椎間盤退變及損傷修復(fù)提供了新的種子細(xì)胞來源。

中科院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心鄒衛(wèi)國研究員和空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科羅卓荊主任為該論文的共同通訊作者。鄒衛(wèi)國研究組博士后、空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科副主任醫(yī)師/副教授高博和鄒衛(wèi)國研究組博士生蔣博為該論文的共同第一作者。感謝分子細(xì)胞卓越中心孫麗明研究員、周波研究員和復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院周兆才教授對研究的幫助，感謝分子細(xì)胞卓越中心細(xì)胞分析技術(shù)平臺(tái)、分子生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)的大力支持。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1002/advs.202104888

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