針對實體瘤的 CAR-T 細胞臨床試驗的安全性和結果

大多數臨床試驗通過靜脈注射 CAR-T 細胞（n=105；圖 2）來應用 CAR-T 細胞，計數 T 細胞正確歸巢到腫瘤。然而，也有其他可能的部位，特別是如果人們想將 CAR-T 細胞非常局部地應用于腫瘤或切除部位。例如，治療腦腫瘤的試驗使用顱內 (n=2)、腔內 (n=3) 或腦內 (n=6) 注射，或注入心室系統 (n=8)（圖 2）。

19 項臨床試驗表明瘤內注射，9 項使用腹腔注射（圖 2）。CAR-T細胞局部治療肝癌或胰腺癌可以通過經導管動脈輸注（TAI；n=3）、肝內動脈注射（n = 10）、胰動脈（n=1）或胰靜脈（n=1）注射（圖2）。共有 56 項臨床試驗未指明 CAR-T 細胞應用的部位（圖 2）。

圖2. 用于將 CAR-T 細胞應用于實體瘤的注射部位示意圖。數字表示使用該注射部位的臨床試驗次數。

如上所述，在針對實體瘤的 CAR-T 細胞臨床試驗中，大多數靶向抗原并不完全具有腫瘤特異性。可能是抗原在正常健康組織上有一定程度的表達，并且由于意外殺死了共表達靶抗原的非惡性旁觀細胞，CAR 可以誘導在靶上/腫瘤外毒性-T 細胞 [11]。為了能夠在患者發現毒性后立即關閉 CAR-T 細胞，開發了多種策略（圖 3）。

Rimiducid (AP1903) 和雷帕霉素是能夠誘導含有誘導型半胱天冬酶 9 的構建體二聚化的分子，它們與 CAR 共同引入 T 細胞作為自殺開關。二聚化后，caspase 9 誘導 CAR-T 細胞凋亡，從而消除不需要的/意外的 T 細胞活性 。這種自殺開關用于 17 項臨床試驗（圖 3），主要使用第四代安全 CAR-T 細胞（4SCART）進行。

有趣的是，rimiducid (AP1903) 還用于將基于 MyD88 和 CD40 (iMC) 的誘導型共刺激分子多聚化為 T 細胞，從而在體內選擇性激活過繼轉移的 T 細胞，從而增強抗腫瘤作用實體瘤中的活性（圖 3）。去除 rimiducid將再次關閉這種共刺激。

圖 3. CAR-T 細胞治療實體瘤的安全性測量示意圖。數字表示使用此安全性測量的臨床試驗數量。

使用的最古老的自殺開關之一是單純皰疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韋 (HSV-tk/GCV) 策略。從機制上講，HSV-tk磷酸化 GCV，產生的三磷酸形式被 DNA 聚合酶整合到 DNA 中，導致鏈終止和細胞死亡。HSV-tk/GCV 也誘導細胞凋亡 。使用HSV-tk/GCV的一個缺點是它在免疫活性患者中可能具有免疫原性，導致 HSV-tk轉導細胞的持久性有限。盡管如此，三項臨床試驗仍然使用HSV-tk/GCV 策略（圖 3）。

此外，一些修剪過的分子用于選擇和/或去除 CAR-T 細胞，如截短的 HER2 (HER2tG)、截短的 EGFR (tEGFR) 和截短的 CD19 (tCD19)（圖 3）。曲妥珠單抗 (Herceptin?) 與 HER2tG 結合并在兩項臨床試驗中用于通過補體或抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC) 消除 CAR-T 細胞的靶向/脫瘤反應（圖 10）。在八項臨床試驗（圖 3）中，西妥昔單抗通過相同的機制用于消融表達 tEGFR 的 CAR-T 細胞。七項臨床試驗使用截短的 CD19 作為 CAR 陽性 T 細胞的選擇標記，或使用與假單胞菌毒素 (CD19-ETA’) 偶聯的抗 CD19 抗體作為消除標記（圖 3）。一項臨床試驗使用未公開的“終止開關”作為安全措施（圖 3）。

避免由 CAR 的靶向/非腫瘤反應引起的長期自身免疫的特殊安全措施是通過 mRNA 電穿孔引入CAR（n=5, 2.6%）。我們之前已經證明，使用mRNA電穿孔用 CAR 瞬時轉染 T 細胞可能是癌癥免疫治療中一種有效且安全的工具 。

電穿孔程序基于復雜的物理化學機制，在施加電場后導致質膜穿孔，從而允許 mRNA 隨后進入細胞質。使用 RNA 轉染的CAR-T細胞的優勢在于受體表達受到時間限制（圖 4），從而使潛在的脫靶和脫靶/脫腫瘤毒性也瞬間發生。CAR-RNA 轉移策略在探索用于CAR-T細胞療法的新腫瘤抗原的 0/1 期臨床試驗中特別有吸引力，但臨床安全性未知。

圖4.通過mRNA電穿孔引入 CAR 的示意圖。表明引入的mRNA隨著時間的推移穩定性低，并且CAR在T細胞表面上的瞬時表達。?

CARs mRNA 轉染策略同時也被其他人應用于臨床試驗。在實體瘤患者中，c-MET 被用作乳腺癌和黑色素瘤的 CAR 靶抗原，（NCT01837602；NCT03060356）和間皮素用作間皮瘤、胰腺癌和卵巢癌的 CAR 靶抗原 , (NCT03608618; NCT01897415; NCT01355965)。

甚至使用 CD19 和 CD123 作為靶抗原對非實體瘤進行了 RNA 轉染，（NCT02277522；NCT02624258；NCT02623582）。這些研究中的 mRNA-CAR-T 細胞耐受性良好，細胞遷移到原發和轉移性腫瘤部位，顯示出臨床抗腫瘤活性，并且沒有證據表明對正常組織。局部應用后，c-MET-CAR-T細胞誘導腫瘤內壞死。重要的是，一些注射的 c-MET-CAR-T 細胞進入血流，可以在循環中進行短時間監測。

Beatty等人發表的臨床試驗和 Maus 等人使用間皮素作為抗原，在完成第三次輸注后的幾分鐘內，在一名間皮瘤患者中顯示出細胞因子釋放綜合征 (CRS)，導致不良事件（過敏反應、心臟驟停、呼吸衰竭、彌散性靜脈內凝血。

相比之下，在胰腺癌患者中，沒有細胞因子釋放綜合征，也沒有劑量限制性毒性，但在 6 名患者中有 2 名實際上病情穩定]。使用RNA-CAR-T細胞時，穩健的增殖和持久性并不那么重要，因此無需進行淋巴耗竭，因為瞬時受體表達本身就需要重復注射。與在clinicaltrials.gov注冊的大多數試驗使用病毒轉導細胞不同，這些試驗只需要應用一次，假設這些細胞會在腫瘤抗原識別后增殖，不需要重復應用，RNA轉染的細胞將失去CAR表達（圖 4) 并且必須從外部補充以維持對腫瘤的細胞溶解壓力。

Maus等人在上述患者中描述的嚴重不良事件的可能原因。和比蒂等人， CAR 是基于鼠類抗體，不良事件是由 CAR 中的 scFv 特異的 IgE 抗體引起的（即人類抗小鼠抗體 (HAMA) 反應），隨后導致 CRS額外注射CAR-T細胞。這些抗體可能是由 CAR-T 細胞的間歇給藥方案誘導的。在第 0 天和第7天前兩次注射 RNA CAR-T 細胞后，在第49天漫長的等待期后進行第三次注射。這足以完成從 IgG 到 IgE 的同種型轉換。因此，如果誘導 HAMA 反應，快速重復輸注似乎是防止同種型轉換的最佳方法。

盡管如果 CAR-T 細胞誘導了靶向/非腫瘤反應，通過用 mRNA 電穿孔在 T 細胞的細胞表面上瞬時表達 CAR 可能是一個優勢，但它也可能是適用性的劣勢.必須仔細監測注入的 CAR-T 細胞是否在 CAR 表達過低而無法有效抗腫瘤反應之前及時到達其腫瘤靶點。這可能會通過在腫瘤部位局部輸注這些 CAR-T 細胞來規避，因為它已在多項臨床試驗中進行（NCT01355965、NCT01897415、NCT03608618、NCT01837602）。

此外，mRNA 轉染 CAR-T 細胞的必要重復應用存在一些危險，如上文詳細描述的（例如，HAMA 反應可能的同種型轉換）。此外，這種重復應用需要生產和儲存多批 CAR-T 細胞，這可能很麻煩。此外，接受 mRNA 轉染的 CAR-T 細胞治療的患者不會誘導抗腫瘤 CAR-T 細胞記憶，如果腫瘤沒有完全根除并且可能再次發生，這可能是一個問題。為了對 mRNA 轉染的 CAR-T 細胞的適用性得出最終結論，需要對多項臨床試驗進行分析。為了減輕安全問題，另一個有前景的策略是最初使用重復注射 RNA 轉染的 CAR-T 細胞來探測毒性，在沒有嚴重副作用的情況下，改用永久轉染的 CAR-T 細胞。

在clinicaltrials.gov 注冊的使用CAR-T 細胞治療實體瘤的所有臨床試驗的總結性審查表明，使用許多不同的CAR結構、應用途徑和引入T細胞的額外功能遵循了許多策略。這可能表明，尚未找到用CAR-T細胞治療實體瘤的理想策略。這也可以在報告這一點的試驗的臨床結果中看到；375名患者中只有52名有反應。盡管如此，使用CAR-T細胞治療實體瘤蘊藏著巨大的機遇，需要進一步的開發和臨床測試才能滿足治療此類癌癥的高醫療需求。

4.1 臨床結果

在clinicaltrials.gov注冊的42項使用CAR-T細胞治療實體瘤的臨床試驗中，臨床結果可以從clinicaltrials.gov或通過pubmed.ncbi.nlm.nih.gov上的文獻搜索檢索（見表S1；還包括有關注射細胞數量、試驗階段、（估計）患者數量、試驗狀態、主要研究者和參考文獻的數據）在臨床腫瘤學雜志上發表的 ASCO 會議摘要中發現了一些臨床結果。在報告臨床結果的出版物中列出的 375 例接受治療的患者中，13 例完全緩解，35 例部分緩解，4例混合緩解，121例疾病穩定，109例疾病進展，8例無疾病證據，5例不可評估，80例患者的臨床結果未公開。

4.2 不良事件

本綜述中描述的總共28項臨床試驗也報告了不良事件（表 S1）。不良事件非常多樣（圖 5）。一些不良事件是非常局部的，這可以通過觀察腫瘤部位來解釋（例如，治療膠質母細胞瘤時癲癇發作，或治療肝臟腫瘤時腹痛）。然而，也有更普遍的不良事件，例如：發燒、疲勞、惡心/嘔吐、呼吸系統毒性/呼吸困難等（圖 5）。盡管只有五項臨床試驗直接報告了血清細胞因子釋放或細胞因子釋放綜合征 (CRS)（圖 5），但這可能是低估了。對于急性淋巴細胞白血病(ALL)，據描述，在接受CD19-CAR-T細胞治療的患者中，77%的患者普遍存在CRS。

據悉，在這些患者中，CRS的臨床表現包括輕度發熱伴頭痛、肌痛等多種癥狀，但也有高熱、低血壓、急性呼吸窘迫綜合征、彌散性血管內凝血、器官衰竭和死亡等癥狀。此外，還描述了C反應蛋白(CRP)和IL-6 值升高，以及多器官衰竭、凝血參數紊亂和血細胞減少的跡象。圖5中列出的不良事件，以及表S1中詳細總結的所有報告的不良事件數據，以及ALL患者CRS癥狀的描述，表明更多的細胞因子釋放綜合征病例是由帶有CAR-T細胞的實體瘤。

圖 5. CAR-T 細胞治療實體瘤期間描述的不良事件（所有級別）的示意圖概述。指出了報告特定不良事件的臨床試驗數量。

CAR-T 細胞治療的另一個不良事件是CAR誘導的神經毒性，但是，這種神經毒性的機制尚不清楚。經毒性的癥狀包括一過性認知障礙、幻覺和譫妄，還有腦病和癲癇發作。?

因此，上述治療膠質母細胞瘤患者的癲癇發作（NCT02209376）也可能是神經毒性的征兆。此外，一項試驗描述了神經系統事件（NCT00730613），而在另一項試驗中，不良事件之一是嗅覺先兆（NCT02208362），這兩者都可能表明神經毒性。

參考文獻：

The Landscape of CAR-T Cell Clinical Trials against
Solid Tumors—A Comprehensive Overview；doi：10.1111/sji.12910；doi:10.3390/cancers12092567。

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