外泌體：是一種細胞主動分泌的大小均一、直徑為50-150 nm的脂質雙分子層結構囊泡，可由樹突細胞、淋巴細胞、成纖維細胞、間充質干細胞和腫瘤細胞等多種不同類型細胞釋放。外泌體含有多種RNA、蛋白質、脂質、DNA等物質，具有多種生物學作用，近年來引起科研界的廣泛關注。
隨著外泌體研究的深入，越來越多的實驗證實外泌體用于疾病治療的有效性，如何穩定保存外泌體、不喪失其功能顯得尤為重要。
探索凍干技術與常規凍存方法保存脂肪干細胞外泌體的形態學差異，探索外泌體凍干粉用于機體注射的安全性。
實驗室中常規的外泌體存儲條件一般是4℃、-20℃、-80℃。在一項研究中[1]，研究者評估了儲存在4℃，-20℃和-80℃下長達28天的外泌體的穩定性，并將其與新鮮的外泌體進行了比較。
研究者發現，與新鮮分離的外泌體相比，不同的存儲溫度和存儲時間會影響外泌體的穩定性、大小分布和顆粒數量（Fig.1），并影響了外泌體的細胞吸收和生物分布（Fig.2）。
對于功能性研究，根據研究設計建議對新鮮分離的外泌體進行立刻分析或在4 ℃或-20℃下短期保存后使用。但是對于長期保存用于治療應用的外泌體，-80℃存儲條件將是更可取的。
上海交通大學研究了不同pH、溫度和凍融次數等儲存條件對外泌體的數量變化和細胞攝取的影響并于2019年4月發表在Protein & Cell雜志上。研究人員將提取得到的外泌體等分成若干等分，每個部分在不同溫度（-80℃， -20℃，4℃，37℃和60℃）下儲存，或通過1-5個循環冷凍至-80℃并解凍。24小時后，進行NTA和WB檢測外泌體的剩余量。
（A）通過NTA檢測在不同溫度下儲存24小時的外泌體的相對濃度。
（B）在樣品在不同條件下儲存24小時后，
通過WB檢測三種外泌體標記物TSG101，HSP70和ALIX的水平。
(A)(B)圖的結果顯示在4℃下儲存的外泌體具有最高濃度。
（C）在外泌體儲存于?80 °C，?20 °C及4 °C 下0，7，15及30天后，
通過WB檢測三種外泌體標記物TSG101，HSP70和ALIX的水平。
（C）圖中檢測了在不同溫度（-80℃，-20℃，4℃）下長期儲存的外泌體相關蛋白的水平。ALIX，HSP70和TSG101的水平隨儲存時間延長而顯出下降趨勢，在-20℃和4℃的降解速度大于-80℃下的蛋白降解速度。在4℃下放一個月，外泌體上的標記蛋白幾乎完全降解。
（D）不同的凍存次數下外泌體標記物TSG101，HSP70和ALIX的水平。
（D）圖表明反復凍融會造成外泌體標記物水平的降低，其可能的機制是造成了膜的破壞。
凍干技術在外泌體存儲中的應用
凍干技術簡史
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干燥是保持物質不致腐敗變質的方法之一。干燥的方法許多，如曬干、煮干、烘干、噴霧干燥和真空干燥等。但這些干燥方法都是在0℃以上或更高的溫度下進行。干燥所得的產品，一般是體積縮小、質地變硬，有些物質發生了氧化，一些易揮發的成分大部分會損失掉，有些熱敏性的物質，如蛋白質、維生素會發生變性。
微生物會失去生物活力，干燥后的物質不易在水中溶解等。因此干燥后的產品與干燥前相比在性狀上有很大的差別。而冷凍干燥法不同于以上的干燥方法，產品的干燥基本上在0℃以下的溫度進行，即在產品凍結的狀態下進行，直到后期，為了進一步降低產品的殘余水份含量，才讓產品升至0℃以上的溫度，但一般不超過40℃。
古代的斯堪的納維亞人（Vikings）利用北冰洋干爽寒冷的空氣生產一種脆魚。南美古印第安人利用自然條件冷凍干燥生產一種被稱為chuno的馬鈴薯淀粉。
1890年，阿特曼在制作生物標本時，為防止標本中的成分在有機溶劑中解，采用冷凍干燥法制作標本。
1909年謝蓋爾將凍干機引入細菌學和血清學。他采用鹽冰預凍，在真空狀態下，用硫酸作吸水劑，對抗毒素、狂犬病毒等進行凍干，其設備十分簡陋，但卻是后來凍干機的雛形。
1935年，第一臺商用凍干機問世。自此以后冷凍干燥技術不再是實驗室內科學研究的手段。1940年，凍干人血漿投放市場。第二次世界大戰中，由于需要大量的凍干人血漿和青霉素，因而凍干技術在醫藥等方面的應用得到迅速發展。
1949年弗洛斯道夫第一本有關凍干技術和理論的書籍。
1951年和1958年在英國倫敦先后召開了第一屆和第二屆以凍干為主題的專題討論會。
凍干技術起源于二戰時期，最初被應用于保存血液制品，使其輕便且易攜帶。二戰結束后，由于各國經濟復蘇的需要，凍干技術被逐漸應用到醫藥、生物、航天航空等領域。? 20世紀90年代，生物藥品的出現，促進凍干技術向更加精致、深入的方向發展。
凍干粉從早期應用于醫藥領域延伸到現在的護膚品行業，絕非偶然，是科技進步、行業發展及消費者日益增長需求的必然產物。
國內在70年代開始生產制造凍干機，當時由于生產工藝落后，加工水平較低，制造的凍干設備遠遠落后于國際凍干設備，因此，遠不能滿足國內凍干生產的要求。
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90年代，國內出現多家仿制國際一流凍干機的生產廠家，其產品都達到了替代進口凍干機要求。
95年開始國內對凍干機提出了新的要求，為滿足國家藥品生產管理的需要，滿足藥品生產的凍干機開始大量運用在藥品生產中。
凍干技術和設備在中國的發展歷史
外泌體作為治療試劑或藥物遞送載體有廣泛的應用前景，但外泌體存儲在-80°C將不利于其運輸及應用，因此還需要其他存儲方法。
凍干是一種已用于保存多種類型的生物材料（蛋白質，血漿、活細胞等）的技術。此外，凍干技術已被用于改善藥物遞送載體脂質體的長期穩定性。因此，凍干技術有可能改善外泌體的保存穩定性，如果凍干的外泌體可以在室溫條件下穩定保存，外泌體的應用范圍則將會大大提升。
Fig.1??不同存儲條件和不同存儲時間下外泌體的NTA檢測結果
2016年科學家Johnny等人從膠質瘤患者腦脊液中分離的外泌體，溶解于PBS緩沖液后進行凍干，外泌體凍干粉在室溫中存放了7天后，發現外泌體顆粒數減少了37–43%?[2]；
2018年科學家Elia等人在間充質干細胞外泌體中試生產中使用了凍干技術，并針對凍干的外泌體進行了理化檢測[3]；
2018年科學家Chonlada等人通過海藻糖作為凍存保護劑進行黑色素瘤外泌體凍干，在25℃條件下可以穩定保存4周時間[4].?
2019年Khairat等人使用海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮40（PVP40）作為干細胞外泌體的凍存保護劑，摸索兩者之間的不同比例來尋找合適的保護劑[7]；
海藻糖是蘑菇、蝦、昆蟲和細菌中所含的一種天然的非還原性的二糖。海藻糖被食品和化妝品工業廣泛用作構造劑，穩定劑或保濕劑，并用作不穩定蛋白藥物，疫苗和脂質體以及用于移植的細胞和器官的（低溫）防腐劑。多項毒性研究確定了口服，胃或腸胃外給藥后海藻糖在小鼠和人類中的安全性和耐受性。海藻糖為多種生物物質提供保護作用，包括穩定蛋白質，細胞膜和脂質體，減少冷凍過程中細胞內冰形成以及防止蛋白質聚集的能力[4，5, 7]。
化學式為C6H14O6，是一種糖醇，是山梨糖醇的同分異構體，易溶于水，為白色結晶性粉末，有類似蔗糖的甜味，常用的凍存保護劑。甘露醇不僅可作為優良的骨架劑使用，而且在一些處方中它能夠兼作蛋白質的凍干保護劑。甘露醇對蛋白質的保護作用與其濃度、形態結構有關，而其濃度與結晶形態有時呈一定的關聯性。通常認為無定型甘露醇具有使蛋白質穩定的作用而結晶態的甘露醇則失去保護功能；1%或更低濃度的甘露醇通過無定型結構的形成而阻止蛋白質藥物的聚集，但是高濃度的甘露醇則易于形成結晶態而促進蛋白質藥物的聚集[3，6]。
外泌體凍干技術將極大地促進其藥物開發，凍干外泌體保留了生物活性，不需要昂貴的冷鏈或其他復雜的存儲條件。此外，將來需要對含外泌體的核酸（例如miRNA）進行更詳細的評估，并探討凍干對其穩定性的影響。外泌體-RNA不僅對于細胞反應的傳遞很重要，而且對于將外泌體用于診斷環境也很重要。評估更詳細的凍干外泌體如何與其靶組織相互作用也很重要。
1, ?Preservation of small extracellular vesicles for functional analysis and therapeutic applications: acomparative evaluation of storage conditions. Drug Deliv. 2021 Dec;28(1):162-170.
2, ?Optimizing preservation of extracellular vesicular miRNAs derived from clinical cerebrospinal fluid. Cancer Biomark. 2016 Mar 25;17(2):125-32.
3,?Pilot Production of Mesenchymal StemStromal Freeze-Dried Secretome for Cell-Free Regenerative Nanomedicine. Cells. 2018 Oct 30;7(11):190.
4, ?Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. Int J Pharm. 2018 Dec 20;553(1-2):1-7.
5, Post-production modifications of murine Mesenchymal Stem Cell 1 (mMSC) derived Extracellular Vesicles (EVs) and impact on their cellular interaction.?Biomaterials. 2020 Feb;231:119675.
6，Freeze-dried and GMP-compliant pharmaceuticals containing exosomes for acellular mesenchymal stromal cell. Nanomedicine (Lond). 2019 Mar;14(6):753-765.
7, Freeze-Dried Extracellular Vesicles From Adipose-Derived Stem Cells Prevent Hypoxia-Induced Muscle Cell Injury. Front Cell Dev Biol. 2020 Mar 20;8:181.
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