外泌體是如何獲得的

隨著近年來大家對外泌體的認識和了解，外泌體也吸引了諸多科學家的注意，因其能夠為癌癥早期診斷和治療提供有意義的生物標記物。那么對于外泌體分離純化一直是科研工作者關注的問題，獲得高純度的外泌體對后續的研究至關重要。據了解，外泌體的提取方法有多種：包括傳統的差速離心、密度梯度離心，以及后來發展的超濾法、沉淀法、免疫分離、微流控、磁珠免疫法等。這些方法各有利弊：

1、差速離心是從生物體液或細胞上清分離外泌體的金標準方法。采用低速離心、高速離心交替進行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。目前在國外的重要期刊如Cell、Nature、Science以及其眾多子刊中，差速離心是普遍應用的經典技術手段。

差速離心獲取的外泌體純度更高，均一性更好，具有更小的粒徑，但相對于PEG-base沉淀法，差速離心法的產量不高。二者都是實驗室常用的外泌體提取方法，使用超離法提取外泌體，獲取更高純度的外泌體，以減少雜質對應用結果的干擾。

2、密度梯度離心法：密度梯度離心法是在差速離心法的基礎上，根據囊泡與其他生物分子密度和大小的差異，加入分離介質如蔗糖和碘克沙醇等，使其在溶液中停留在不同梯度層，從蛋白質聚集體和非膜性顆粒中分離外泌體。

該方法分離純度高，并且分離介質的緩沖作用還可以減少離心力對外泌體的破壞，適用于進行外泌體的功能學研究、標志物檢測以及內容物的分析，使用該方法已經成功從細胞培養上清、組織等樣本中分離出外泌體。但該方法操作更加復雜，限制了其分離效率及在臨床和診斷研究中的應用。

超濾：外泌體是一個大小約幾十納米的囊狀小體，可以使用多孔膜短時間低速離心對樣本進行選擇性分離，從而獲得外泌體。?分為壓力超濾和離心超濾。此方法簡單高效，但由于過濾膜的粘附，可能會損失外泌體，并且過濾時的壓力和剪切力，可能會破壞外泌體膜結構的完整性。

沉淀的基本原理是使用聚合物分子結合水分子，以此降低外泌體在培養基、尿液等液體中的溶解度，通常使用聚乙二醇(polyethylene glycols, PEGs)。沉淀法的最大便利在于不需要特定設備，就能獲得較多量的外泌體，缺點在于雜質較多。

這一類分離技術的理論基礎是外泌體雙層膜結構上表達有特征性蛋白(marker proteins)，于是可以借助特定的抗體來捕獲外泌體。它的優勢包括基于抗原抗體識別的免疫機制，故純度較高；同時根據不同的表面標記，可以區分不同的亞組，有助于進一步的機制研究。缺點在于樣品制備困難、花費高，且產量較低。

基于微流控的分離方法是兼顧外泌體物理屬性和生物化學屬性的新方法，主要步驟包括免疫親和(immunoaffinity)、過篩(sieving)、多孔結構捕獲外泌體(trapping)，僅需少量樣本即可。將微流控技術和前面的分離方法聯用的話，可以提高產量和純度，可惜技術門檻較高，有礙大規模使用

將針對目的抗原的抗體通過生物素-鏈霉親和素連接到磁珠表面，然后將磁珠與樣品共孵育，使外泌體特異性結合到磁珠上形成磁珠-外泌體復合物，再用蒸餾水或者PBS沖洗，最后用甘氨酸-Tris-HCl溶液洗脫獲得外泌體。

該方法相對于ELISA的好處主要是，珠粒提供了更大的表面積來捕獲外泌體，從而提高了分離效率。此外，使用磁珠時，樣品起始體積沒有上限，而基于微孔板的ELISA分析的最大樣品體積為100μL，且ELISA洗脫雜質時容易造成孔間交叉污染。當將磁珠法與金標準外泌體分離方法進行比較時，磁珠法可分離出更純凈的外泌體，特異性高、速度更快，并且不需要昂貴的儀器。另外，與其他分離方法（如超速離心或超濾）相比，磁珠法不影響外泌體形態。但是采用磁珠法時，外泌體生物活性易受PH和鹽濃度影響。

本文對常見的幾種外泌體分離方法進行了綜述，并分析了每一種分離方法的優缺點、適用條件。

目前看來，這些方法的組合使用可能優于單一的外泌體分離方法。隨著研究的深入以及科技的不斷進步，越來越多的外泌體分離技術及其組合不斷涌現，外泌體的更多生物學功能終將被發掘，最終實現外泌體研究服務于臨床診斷和治療的目標，也將使未來精準醫學更加便捷。