外泌體治療：是否會成為醫藥領域的下一個風口

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外泌體是（exosomes）一種活細胞分泌的囊性小泡，攜帶大量具有組織或細胞特異性的蛋白質、脂質及遺傳物質，可調控不同的生理活動，因此作為一類新興的治療藥物被廣泛研究。間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)和樹突狀細胞 (dendritic cells, DCs)來源的外泌體是研究較為廣泛的兩類外泌體，已有許多臨床前及臨床研究表明其在肺部疾病、肝臟疾病、神經系統疾病及腫瘤等疾病中展現出良好的治療效果。另外，巨噬細胞、腫瘤細胞和植物細胞等眾多其他細胞衍生的外泌體也因其治療潛力受到越來越多的關注。除了天然來源的外泌體，工程化外泌體的研究也取得了鼓舞人心的進展。已報道的外泌體工程化手段種類繁多，如外泌體靶向修飾、外泌體包載活性成分等。本文總結了不同來源的治療性外泌體的研究進展，并討論了外泌體的應用前景與未來可能遇到的挑戰。

外泌體的細胞來源、分離、工程化及臨床應用

背景介紹

圖1細胞外囊泡的生物發生和組成的示意圖

圖2 外泌體中存在的生物因子

外泌體通過轉移特異性mRNA，抑制或刺激免疫調節，促進器官排泄，以及從大腦中去除代謝廢物來調節受體細胞的基因表達。在治療方面，外泌體本身具有生物活性。因此，不需要進行更多的修飾，并且可以從細胞中分離，起到治療作用。

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細胞外囊泡亞型特征

細胞外囊泡所包含的凋亡小體、微泡和外泌體的大小、性狀及內容物等信息見表1。

表1 細胞外囊泡亞型特征

外泌體形成機制

外泌體的形成涉及兩次細胞質膜內陷，如圖3。細胞質膜首先通過內吞作用內陷進入細胞質，并攜帶來自細胞質膜和細胞外環境的早期分泌物。內陷的芽可以形成早期的核內體（endosome，ESEs），或與內質網（ER）、高爾基體反面網絡結構（TGN）或線粒體成分形成ESEs融合。第二次膜內陷是后期內吞體膜向內出芽，并導致腔內囊泡（ILVs）的形成。在這個過程中，來自ESEs和細胞質的運載物稱為ILVs。同時，晚期分選的核內體與ER和TGN交換運載物，隨后是含有多個ILVs的多泡體（MVBs）的成熟。成熟的MVBs要么與溶酶體和/或自噬體融合，導致運載物質的降解和循環，要么將ILVs運輸到質膜，通過胞吐作用釋放ILVs，即為外泌體。

圖3 外泌體的形成機制

ILVs的形成是外泌體生成過程中的主要物質，ILVs的形成依賴和/或非依賴經典的細胞內蛋白轉運系統（ESCRT）。研究表明，與ESCRT依賴通路相關的蛋白，主要是TSG101、HSC70和HSP90b，均富含外泌體。此外，ESCRT通路的輔助蛋白，如ALIX和syntenin,，也可在外泌體中檢測到。上述蛋白通過橋接效應在運載物質的篩選和運輸中起著至關重要的作用。

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外泌體信號傳導

外泌體具有蛋白質組學和遺傳信息，并通過3種機制發揮蛋白質、脂質及遺傳物質的運輸作用。主要是發生L-R結合（L-配體，R-受體），即外泌體與其受體上的特定配體結合，從而激活靶細胞。其次，外泌體可能通過出芽過程將表面受體從一個細胞傳遞到目標細胞。隨后，供體細胞的胞質內容物通過膜融合水平移動到靶細胞。外泌體的種類、生物發生機制及特點描述見圖4。

圖4 外泌體的種類、生物發生機制及特點

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外泌體與疾病

EVs與腫瘤、神經退行性疾病和心血管疾病的發生、發展相關。腫瘤來源的EVs包含各種致癌因子，這些因子能夠加速腫瘤的生長，并促進向健康受體細胞內化后的轉移。它們還可以操縱和啟動支持性組織，以產生一個理想的轉移微環境。腫瘤來源的EVs可以作為診斷標記物，因為它們包含了代表親代腫瘤細胞的物質。

在生理條件下，EVs可以從神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞中釋放出來，作為細胞間信號傳遞的工具。然而，含有神經毒性蛋白的EVs，如感染性朊病毒蛋白或淀粉樣蛋白-β（Aβ）可參與將病理蛋白擴散到鄰近的健康神經元，導致神經退行性疾病，如朊病毒病和阿爾茨海默病。

腦源性EVs還含有蛋白質和microRNA（miRNA），它們可以打破血腦屏障，并可能被釋放到外周，然后可以在血液中分離出來，用作神經退行性疾病的生物標志物。內皮細胞、平滑肌細胞、血小板和白細胞分泌的EVs含有凋亡因子和促炎和抗炎細胞因子，這可能會導致動脈粥樣硬化病變和心肌功能的喪失。如圖5所示，淺藍色方框的內容描述了利用EVs來治療這些疾病的方法。具體的治療手段如圖6所示。

圖5 EVs在癌癥、神經退行性疾病和心血管疾病中的作用

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治療性靶向EVs和產生治療性EVs的方法

不同來源的外泌體有不同的特性，可能適用于不同的疾病的治療。天然外泌體（EVs）含有從不同細胞來源、細胞分泌的有益蛋白質或目標核酸，可以被分離出來并用于治療疾病。此外，可以將有治療作用的載荷裝載到外泌體中，從而起到治療作用。靶向表面受體或配體可用于將EVs傳遞到目標受體細胞。EVs被分離后，可以外源性地裝載目標蛋白質和核酸。該領域主要集中于開發針對癌癥、神經退行性疾病和心血管疾病的EVs。疾病介導的EVs的攝取和內化也可以被miRNA或microRNA抑制。治療性靶向EVs和產生治療性EVs的方法見圖6。

圖6 治療性靶向EVs和產生治療性EVs的方法

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治療性外泌體研究進展

細胞的許多生物學效應依賴于它們的分泌物，更具體地說，是EVs。因為它們可以體現母細胞的大量生物學效應，EVs被認為是潛在的治療藥物。許多研究表明，它們在生物體中的出現可以作為疾病預測的生物標志物（見圖7），并在生物醫學公司中得到廣泛應用。從事外泌體研究的龍頭企業見表2。

圖7?外泌體生物標志物

表2 從事外泌體研究的企業

外泌體臨床試驗研究進展

臨床前研究證明，不同細胞來源的外泌體對心臟、腎臟、肝臟、大腦和皮膚損傷有很好的治療作用。此外，外泌體作為載體可用于封裝治療性藥物，保護藥物不被降解，并盡量減少其毒性。根據美國臨床試驗注冊庫(ClinicalTrials.gov)數據顯示，目前基于外泌體治療，開展臨床試驗的登記數量為28項。速度最快的為Direct Biologics
LLC研發的用于成人呼吸窘迫綜合征及COVID-19的間充質干細胞外泌體，目前正處于三期臨床階段。外泌體的特性描述見圖8。

圖8 EVs產品特性描述

（1）產品開發立項前“三思而行”

目前用于研究的外泌體主要來源于人類或動物的組織及體液，或植物類、微生物類。根據研究的深入程度及臨床療效，來源于人類細胞的外泌體是各個企業產品開發的熱點。在正式立項之前，研究者需要做出的關鍵戰略選擇是：（1）應用原代細胞還是細胞系？（2）選擇自體細胞還是異體細胞？（3）選擇天然性外泌體還是經過修飾的外泌體？

（2）應用原代細胞還是細胞系？

外泌體可以來源于原代細胞或細胞系。符合GMP標準的細胞系已上市；有些細胞系在歐洲通常被用于生產生物藥品，如重組蛋白和疫苗。哺乳動物細胞（CHO、NS0、或Sp2/0）已被廣泛應用，然而，人類細胞經常被用于新產品的開發。在HEK293、HT-1080或PER.C1細胞系中生產的重組蛋白已獲得上市許可。這些細胞系可能會產生EVs介導的重組分子。然而，未經修飾的原代人類細胞是目前臨床應用中EVs的主要來源，特別是間充質間質細胞（MSCs）和樹突狀細胞（DCs）。考慮到目前正在研究不同種類的細胞類型，這一趨勢可能很快就會改變。

（3）選擇自體細胞還是異體細胞？

自體細胞和異體細胞均可用于EVs的生產。這是體細胞治療中的一個關鍵選擇，關系到不同的治療風險（免疫原性、致癌性等）。目前應用較廣泛的是異體細胞。異體細胞需要制備大型細胞庫存。術語“cell stock”用于原代細胞，而術語“cell bank”指的是細胞系（參考指導原則：EMA/ CAT/852602/2018）。需要著重關注的是異體細胞的免疫原性問題。抗原遞呈細胞和其他細胞可以通過分泌EVs將主要組織相容性復合體（MHC）分子轉移到受體細胞。盡管在動物體內注射EVs免疫原性較低，但需要進一步的臨床研究來驗證對包括免疫細胞在內的大多數細胞類型的EVs免疫應答情況。

（4）選擇天然性外泌體還是經過修飾的外泌體？

許多包括臨床試驗在內的研究，都集中在來自天然的、未經修飾的細胞的EVs上，MSC來源的EVs仍然處于這些研究的前沿。從產品開發和監管的角度來看，使用來自未經修飾的細胞的EVs比較容易進行質量化生產。然而，在某些情況下，需要對細胞進行大量修飾，以確保細胞源的穩定性，或誘導EVs表面或內部特異分子的表達。細胞修飾的目的通常是通過使原代細胞永生化、引入調節細胞周期的病毒基因或致癌基因或操縱人類端粒酶逆轉錄酶（hTERT）來穩定細胞來源。

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