在關(guān)鍵臨床試驗(yàn)期間優(yōu)化 CAR-T 細(xì)胞制造工藝

tisagenlecleucel的CAR由一個(gè)CD19 (FMC63)特異性的鼠單鏈抗體片段組成，然后是一個(gè) CD8-a 鉸鏈和跨膜區(qū)，融合到細(xì)胞內(nèi)CD3-z信號(hào)域和4-1BB共刺激域（圖 1A）。41BB結(jié)構(gòu)域作為T細(xì)胞激活的共刺激信號(hào)，對(duì) tisagenlecleucel的擴(kuò)增、持久性和抗腫瘤活性很重要[3,13,14]。輸注到患者體內(nèi)后擴(kuò)張。當(dāng) CAR 在體內(nèi)與靶細(xì)胞上的CD19結(jié)合時(shí)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)開(kāi)始，導(dǎo)致T細(xì)胞活化、細(xì)胞因子產(chǎn)生和靶細(xì)胞破壞的開(kāi)始。在B-ALL、慢性淋巴細(xì)胞白血病和 DLBCL 患者的臨床試驗(yàn)中，tisagenlecleucel的穩(wěn)健擴(kuò)增和長(zhǎng)期持續(xù)性，以及輸注后持久的臨床反應(yīng)已得到證實(shí)[5,15-17]。

最初的tisagenlecleucel 制造工藝是在賓夕法尼亞大學(xué)（美國(guó)賓夕法尼亞州費(fèi)城）的學(xué)術(shù)中心開(kāi)發(fā)的。此過(guò)程隨后轉(zhuǎn)移到諾華，隨后進(jìn)行優(yōu)化和擴(kuò)展以提供全球臨床試驗(yàn)。為了滿足不斷增長(zhǎng)的需求、解決供體變異性和提高產(chǎn)品質(zhì)量，優(yōu)化和流程改進(jìn)是必要的。這些改進(jìn)側(cè)重于增強(qiáng)合規(guī)性、幫助可擴(kuò)展性和允許全球分銷，并形成了當(dāng)前的制造流程。Tisagenlecleucel在兩個(gè)集中工廠生產(chǎn)，已成功用于全球臨床試驗(yàn)（ELIANA[ClinicalTrials.gov：NCT02435849][5]和 JULIET [ClinicalTrials.gov：NCT02445248][6]），涉及12個(gè)國(guó)家的50多個(gè)臨床中心。

在本文中，我們描述了tisagenlecleucel 制造過(guò)程、橫向擴(kuò)展過(guò)程中遇到的初始挑戰(zhàn)，以及在關(guān)鍵試驗(yàn)期間進(jìn)行的持續(xù)改進(jìn)，以解決最終導(dǎo)致 tisagenlecleucel 商業(yè)制造過(guò)程的挑戰(zhàn)。

Tisagenlecleucel制造工藝

tisagenlecleucel的制造過(guò)程（圖 1B）從通過(guò)白細(xì)胞去除術(shù)從患者身上收集外周血單核細(xì)胞開(kāi)始。這種經(jīng)白細(xì)胞分離的材料在收集后24小時(shí)內(nèi)冷凍保存，并儲(chǔ)存在–120℃以下。然后將冷凍保存的材料運(yùn)送到制造工廠并儲(chǔ)存在 –120℃以下，直到準(zhǔn)備好進(jìn)行進(jìn)一步加工。

在生產(chǎn)線可用時(shí)，患者白細(xì)胞去除術(shù)材料在受控條件下解凍，然后清洗細(xì)胞以去除低溫培養(yǎng)基。使用抗CD3/CD28抗體包被的順磁珠富集、選擇和激活 T 細(xì)胞，然后用含有抗CD19 CAR轉(zhuǎn)基因的自失活慢病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)[2,13]。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，多余的載體和其他殘留物從培養(yǎng)物中洗掉，細(xì)胞在靜態(tài)培養(yǎng)中擴(kuò)增，然后在生物反應(yīng)器中擴(kuò)增。

細(xì)胞擴(kuò)增繼續(xù)離體直到有足夠的細(xì)胞來(lái)滿足最終產(chǎn)品劑量要求。對(duì)于細(xì)胞收獲，轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞通過(guò)將它們與珠子分離、洗滌、在不輸液培養(yǎng)基中配制、轉(zhuǎn)移到輸液袋中并冷凍保存來(lái)分離。執(zhí)行 tisagenlecleucel 的關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQA)（表 1）測(cè)試，并在最終產(chǎn)品發(fā)布后，將冷凍保存的tisagenlecleucel運(yùn)送到治療地點(diǎn)。一旦患者準(zhǔn)備好接受 tisagenlecleucel，細(xì)胞就會(huì)被解凍并立即注入提供白細(xì)胞分離細(xì)胞的同一患者體內(nèi)。

Tisagenlecleucel制造工藝發(fā)展歷程

早期tisagenlecleucel 研究招募的患者相對(duì)較少，這些研究中使用的產(chǎn)品是在賓夕法尼亞大學(xué)使用上述流程制造的[3,4,18-20]。從單一學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)的靈活流程過(guò)渡到全球研究招募來(lái)自眾多臨床站點(diǎn)的患者，在兩個(gè)集中制造中進(jìn)行制造最終導(dǎo)致商業(yè)制造的設(shè)施，需要在許多單采和治療場(chǎng)所以及制造設(shè)施之間進(jìn)行廣泛協(xié)調(diào)[2]。

從初始過(guò)程擴(kuò)大生產(chǎn)的一些挑戰(zhàn)，包括 (1) 整個(gè)制造過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)化和表征過(guò)程和產(chǎn)品；(2)?同時(shí)滿足各個(gè)國(guó)家和地區(qū)的特定監(jiān)管要求；(3) 為手動(dòng)流程確定經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的自動(dòng)化制造解決方案；(4) 在從 1/2 期臨床試驗(yàn)到關(guān)鍵全球試驗(yàn)的過(guò)渡期間管理復(fù)雜的物流。通過(guò)來(lái)自學(xué)術(shù)界、制造、技術(shù)開(kāi)發(fā)、質(zhì)量保證和監(jiān)管部門的不同技術(shù)轉(zhuǎn)讓團(tuán)隊(duì)的合作，開(kāi)發(fā)了技術(shù)轉(zhuǎn)讓過(guò)程的逐步方法（圖 2）。這種合作導(dǎo)致 tisagenlecleucel 制造過(guò)程從學(xué)術(shù)界成功轉(zhuǎn)移到工業(yè)界。

Tisagenlecleucel制造的轉(zhuǎn)移

在用于全球臨床試驗(yàn)的從學(xué)術(shù)制造到工業(yè)制造的過(guò)渡期間，采取了幾個(gè)步驟來(lái)提高工藝性能和穩(wěn)健性，同時(shí)保持 tisagenlecleucel 產(chǎn)品的質(zhì)量（表 1）。一些關(guān)鍵的過(guò)程變化包括加強(qiáng)過(guò)程控制以確保一致性，用自動(dòng)化代替手動(dòng)過(guò)程以確保重現(xiàn)性，驗(yàn)證分析方法以提高一致性，以及使用封閉系統(tǒng)來(lái)防止污染。通過(guò)方法驗(yàn)證和實(shí)施更穩(wěn)健和/或更快的方法來(lái)增加對(duì)分析方法性能的理解是技術(shù)轉(zhuǎn)讓和擴(kuò)展過(guò)程中的重點(diǎn)領(lǐng)域。

一種使用抗獨(dú)特型抗體的 CAR 蛋白表達(dá)定量新方法提高了用于劑量確定的測(cè)定的穩(wěn)健性和線性范圍。用于 CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟的載體的優(yōu)化有助于減少變異性，最大限度地提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并允許擴(kuò)大制造過(guò)程。慢病毒載體制造工藝也得到改進(jìn)，以允許在良好生產(chǎn)規(guī)范 (GMP) 環(huán)境中進(jìn)行大規(guī)模載體生產(chǎn)[2]。

技術(shù)轉(zhuǎn)讓過(guò)程中工藝性能和產(chǎn)品質(zhì)量的可比性是通過(guò)評(píng)估選定的參數(shù)，如細(xì)胞生長(zhǎng)速率、細(xì)胞大小、效力、活力和去除載體殘留物來(lái)建立的（圖 3A）。對(duì)每個(gè) CQA 進(jìn)行了等效性測(cè)試，以證明分析的可比性（圖 3B）。等效驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)置取決于對(duì)制造過(guò)程的理解，并且可以基于方法和/或過(guò)程的可變性。

冷凍保存的白細(xì)胞分離術(shù)被選為優(yōu)于新鮮材料的首選起始材料，以滿足全球試驗(yàn)集中制造的需求，同時(shí)為患者管理提供最大的靈活性。低溫保存的白細(xì)胞去除術(shù)允許在制造延遲的情況下延長(zhǎng)起始材料的儲(chǔ)存，允許可靠和一致的制造，并且最重要的是，為患者提供在最方便和最適合患者的時(shí)間進(jìn)行白細(xì)胞去除術(shù)的靈活性，如與生產(chǎn)線可用性保持一致。對(duì)冷凍保存過(guò)程（包括冷凍保存介質(zhì)、冷凍袋、儲(chǔ)存、冷凍運(yùn)送器、解凍條件和解凍后白細(xì)胞去除術(shù)材料的穩(wěn)定性）進(jìn)行了廣泛評(píng)估，并對(duì)使用冷凍保存起始材料的制造過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化和驗(yàn)證，以用于兒科和年輕成人患者B-ALL 和成人 DLBCL 患者。

計(jì)劃并實(shí)施了后勤控制以滿足預(yù)計(jì)的患者需求。供應(yīng)商和服務(wù)提供商均符合GMP標(biāo)準(zhǔn)，并建立了合作伙伴關(guān)系，以確保關(guān)鍵原材料的長(zhǎng)期供應(yīng)。使用定制軟件開(kāi)發(fā)了一個(gè)控制監(jiān)管鏈的系統(tǒng)，以在將白細(xì)胞去除術(shù)材料從診所運(yùn)輸?shù)街圃斓膖isagenlecleucel返回期間跟蹤患者身份，確保患者被注入自己的細(xì)胞（圖 4）。

在臨床試驗(yàn)期間進(jìn)行了正式的工藝驗(yàn)證。tisagenlecleucel 的CQA是基于患者安全的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試以及臨床療效的產(chǎn)品特異性標(biāo)志物確定的。使用基于風(fēng)險(xiǎn)的方法表征過(guò)程性能并建立關(guān)鍵控制參數(shù)。建立了穩(wěn)健的產(chǎn)品發(fā)布流程，以根據(jù)商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證每種患者特異性 tisagenlecleucel 產(chǎn)品（表 1）的安全性、純度、特性和效力。

Tisagenlecleucel臨床試驗(yàn)期間的早期挑戰(zhàn)和隨后的流程改進(jìn)早期，與滿足多中心試驗(yàn)的制造需求和適應(yīng)觀察到的白細(xì)胞去除術(shù)材料中觀察到的患者間差異相關(guān)的后勤挑戰(zhàn)導(dǎo)致注冊(cè)和輸注之間的退出率高于預(yù)期。為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，我們進(jìn)行了改進(jìn)，以提高制造能力、工藝穩(wěn)健性、工藝成功率和產(chǎn)品質(zhì)量，并縮短生產(chǎn)時(shí)間，如下所述。在臨床試驗(yàn)中獲得的制造經(jīng)驗(yàn)與工藝特性相結(jié)合，有助于確定需要改進(jìn)的特定領(lǐng)域。例如，T 細(xì)胞富集的初始過(guò)程使用多種途徑來(lái)適應(yīng)傳入的患者白細(xì)胞去除術(shù)材料的細(xì)胞群組成的可變性。對(duì)不同選項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)和評(píng)估導(dǎo)致 T 細(xì)胞富集步驟優(yōu)化為單一改進(jìn)途徑，用于一系列傳入細(xì)胞群。這些對(duì) T 細(xì)胞富集過(guò)程的修改導(dǎo)致生產(chǎn)流程簡(jiǎn)化，細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)得到改善，產(chǎn)品質(zhì)量相當(dāng)。如圖 5A 所示，使用這種改進(jìn)的選擇方法與歷史方法相比，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和種群倍增具有可比性；基于等效性測(cè)試證明了這些方法的可比性，這些測(cè)試表明使用修改過(guò)的過(guò)程產(chǎn)生的細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與使用歷史過(guò)程產(chǎn)生的細(xì)胞相當(dāng)或更高。

培養(yǎng)基中使用的人 AB 血清量被確定為潛在的限速步驟，需要減少以克服全球供應(yīng)限制。降低培養(yǎng)基中的血清濃度會(huì)產(chǎn)生具有相同生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和產(chǎn)品質(zhì)量的更可持續(xù)的過(guò)程。如圖 5B 所示，減少血清批次中的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和活白細(xì)胞數(shù)量在歷史制造運(yùn)行的范圍內(nèi)。等效性測(cè)試證明了使用不同過(guò)程生成的細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的可比性。

制造過(guò)程中的另一個(gè)限速步驟是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥典方法進(jìn)行無(wú)菌測(cè)試所需的時(shí)間。驗(yàn)證和使用更快速的基于定量聚合酶鏈反應(yīng)的支原體無(wú)菌檢測(cè)減少了產(chǎn)品發(fā)布前進(jìn)行無(wú)菌測(cè)試所需的時(shí)間。tisagenlecleucel 制造過(guò)程中的嚴(yán)格無(wú)菌測(cè)試是整體無(wú)菌保證策略的一部分，以確保 tisagenlecleucel 不含潛在污染物。這種經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法可確保質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)符合區(qū)域和全球監(jiān)管要求。

設(shè)施和運(yùn)營(yíng)改進(jìn)對(duì)于滿足全球臨床需求是必要的。這些改進(jìn)包括提高制造能力、減少生產(chǎn)時(shí)間和降低患者輟學(xué)率等措施。人員配備進(jìn)行了優(yōu)化，以接收增加的樣品量，并相應(yīng)增加潔凈室容量。模塊化設(shè)施設(shè)計(jì)允許靈活地通過(guò)不斷發(fā)展的制造平臺(tái)進(jìn)行橫向擴(kuò)展，并能夠制造多種適應(yīng)癥的產(chǎn)品（圖 5C）。隨著患者需求的增加，通過(guò)優(yōu)化培訓(xùn)計(jì)劃、增加人員、輪班、優(yōu)化流程和物流來(lái)減少處理時(shí)間。引入了一個(gè)自動(dòng)電子訂購(gòu)系統(tǒng)，以確保從白細(xì)胞去除術(shù)收集到制造再到最終將制造的產(chǎn)品運(yùn)輸?shù)脚R床現(xiàn)場(chǎng)的身份鏈和監(jiān)管鏈都得到維護(hù)。運(yùn)輸物流是確保患者及時(shí)收到藥物的關(guān)鍵，我們對(duì)其進(jìn)行了評(píng)估。該評(píng)估還包括冷凍運(yùn)輸機(jī)的設(shè)計(jì)、溫度控制機(jī)制和提供運(yùn)輸服務(wù)的快遞員。確定需要改進(jìn)的領(lǐng)域并通過(guò)適當(dāng)研究支持的過(guò)程改進(jìn)來(lái)解決這些問(wèn)題，有助于在關(guān)鍵試驗(yàn)期間優(yōu)化制造過(guò)程。

最近，由于輸入的患者材料的可變性增加，在為患有 DLBCL 的成年患者制造的商業(yè)產(chǎn)品中觀察到活細(xì)胞百分比的可變性。盡管存在這種可變性，但這些產(chǎn)品中的大多數(shù)仍然能夠施用于患者。

通過(guò)優(yōu)化的Tisagenlecleucel 商業(yè)制造獲得制造成功和低制造量時(shí)間

在正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)期間，制造過(guò)程中的持續(xù)改進(jìn)導(dǎo)致了 tisagenlecleucel 的一致和優(yōu)化過(guò)程，該過(guò)程能夠適應(yīng)試驗(yàn)期間在傳入的白細(xì)胞去除材料中觀察到的變化（圖 6A）。這使得為制造周期制定了 22 天的目標(biāo)，并在商業(yè)環(huán)境中實(shí)現(xiàn)了相當(dāng)高的制造成功率。這些變化首先在開(kāi)發(fā)研究中進(jìn)行評(píng)估，然后在證明變更后產(chǎn)品的可比性后在臨床試驗(yàn)中引入，這是確保患者獲得質(zhì)量一致的產(chǎn)品所必需的。基于前37種用于B-ALL的商業(yè)生產(chǎn)的 tisagenlecleucel產(chǎn)品（截止日期，2018年1月30日），當(dāng)前流程顯示從在將 tisagenlecleucel 返回臨床站點(diǎn)的制造設(shè)施（包括運(yùn)輸時(shí)間；圖 6B）。在此期間，商業(yè)患者訂單來(lái)自美國(guó)廣闊地理區(qū)域的13個(gè)治療點(diǎn)（圖6C）。正在進(jìn)行的工藝改進(jìn)也有望進(jìn)一步減少制造生產(chǎn)時(shí)間。

年齡小于3歲的患者被排除在 ELIANA研究之外[5]；然而，在商業(yè)環(huán)境中為其制造 tisagenlecleucel 的最年輕患者為2歲。該患者的通過(guò)時(shí)間為24天。3歲以下患者的生產(chǎn)將繼續(xù)受到監(jiān)測(cè)和評(píng)估，以確保T細(xì)胞的可用性以開(kāi)始生產(chǎn)，并確保能夠?yàn)檫@些年輕患者提供適當(dāng)?shù)膭┝俊?/span>

Tisagenlecleucel產(chǎn)品特性

廣泛的產(chǎn)品測(cè)試證明了制造過(guò)程中的產(chǎn)品質(zhì)量始終如一。在 ELIANA試驗(yàn)中對(duì)T細(xì)胞群的評(píng)估（圖7A）表明，從可變的患者白細(xì)胞去除術(shù)起始材料中開(kāi)發(fā)出一致的T細(xì)胞產(chǎn)品。CAR 表達(dá)和每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因拷貝的分析顯示穩(wěn)定的載體整合與在允許范圍內(nèi)觀察到的陽(yáng)性臨床結(jié)果（圖 7B）。在可接受的效力測(cè)定結(jié)果的完整范圍內(nèi)也觀察到了積極的臨床結(jié)果，并且臨床研究期間的臨床反應(yīng)、安全性和體內(nèi)擴(kuò)增不受所選產(chǎn)品特性的影響[16,21]。

結(jié)論和未來(lái)方向

目前tisagenlecleucel的制造工藝反映了具有復(fù)雜制造工藝的細(xì)胞療法如何成功地?cái)U(kuò)展、簡(jiǎn)化和優(yōu)化，以確保為全球患者群體提供高質(zhì)量的產(chǎn)品。通過(guò)專注于增強(qiáng)的關(guān)鍵領(lǐng)域，在不影響產(chǎn)品完整性或效力的情況下，tisagenlecleucel的制造過(guò)程得到了優(yōu)化，并實(shí)現(xiàn)了生產(chǎn)效率。在全球多中心試驗(yàn)中，tisagenlecleucel的集中制造已經(jīng)積累了相當(dāng)多的經(jīng)驗(yàn)。通過(guò)不斷的評(píng)估和改進(jìn)，開(kāi)發(fā)了一種一致且穩(wěn)健的tisagenlecleucel商業(yè)制造工藝。當(dāng)前的制造過(guò)程基于前37名商業(yè)患者（對(duì)于 B-ALL），導(dǎo)致從制造工廠收到白細(xì)胞去除材料到制造的tisagenlecleucel 返回臨床站點(diǎn)的中位時(shí)間為23天，包括運(yùn)輸時(shí)間。預(yù)計(jì)正在進(jìn)行的、持續(xù)的工藝改進(jìn)將導(dǎo)致tisagenlecleucel制造的進(jìn)一步增量增強(qiáng)，并進(jìn)一步減少?gòu)慕邮馨准?xì)胞去除術(shù)材料到返回制造產(chǎn)品的生產(chǎn)時(shí)間。