冷凍后NK細(xì)胞效力減半？揭秘外周血來(lái)源與臍帶血來(lái)源哪個(gè)更靠譜！

臍帶血（CB）是治療性抗腫瘤效應(yīng)NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的一個(gè)重要來(lái)源，從臍帶血可以獲得大量淋巴細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞，這擴(kuò)大了其臨床潛力，甚至在治療血液病方面超過了造血干細(xì)胞（HSC）移植。

比如，治療性的離體擴(kuò)增NK細(xì)胞可用于過繼性細(xì)胞免疫療法，可在臨床上應(yīng)用于治療血液系統(tǒng)和實(shí)體惡性腫瘤。

全球范圍內(nèi)儲(chǔ)存了超過600,000單位的臍帶血，驗(yàn)證這種冷凍來(lái)源NK細(xì)胞的治療能力非常重要。盡管已有研究證明了在造血干細(xì)胞移植中使用長(zhǎng)期冷凍保存臍帶血的臨床功效，但對(duì)其用于效應(yīng)免疫細(xì)胞離體擴(kuò)增的效果卻知之甚少。

來(lái)自加拿大麥克馬斯特大學(xué)和全國(guó)兒童醫(yī)院的科學(xué)家在《Journal of immunotherapy》發(fā)表了題為“Ex Vivo-expanded Natural Killer Cells Derived From Long-term Cryopreserved Cord Blood are Cytotoxic Against Primary Breast Cancer Cells”的研究論文，考察了長(zhǎng)期冷凍保存的臍帶血在臨床上是否可以應(yīng)用于治療性NK細(xì)胞的離體擴(kuò)增。

論文截圖

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來(lái)源：公開資料

研究者使用人工抗原呈遞細(xì)胞介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)，從長(zhǎng)期冷凍保存的臍帶血中獲得了離體擴(kuò)增的NK細(xì)胞，并比較了新鮮（n=4）、短期凍存（）和長(zhǎng)期凍存擴(kuò)增的臍帶血擴(kuò)增NK細(xì)胞的潛力，以及抗腫瘤效應(yīng)功能（1-10年，n=5）。

結(jié)果證明，可以從長(zhǎng)期冷凍保存的臍帶血中獲得指數(shù)數(shù)量的擴(kuò)增CB-NK細(xì)胞（臍帶血衍生的NK細(xì)胞）。而且，來(lái)自新鮮、短期冷凍保存或長(zhǎng)期冷凍保存臍帶血的擴(kuò)增CB-NK細(xì)胞之間的總倍數(shù)擴(kuò)增沒有顯著差異。

來(lái)自新鮮、短期冷凍保存或長(zhǎng)期冷凍保存臍帶血的CB-NK細(xì)胞具有類似的、穩(wěn)健的對(duì)數(shù)規(guī)模擴(kuò)增

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來(lái)源：Nham T. et?al, 2018

既然從擴(kuò)增數(shù)量上并沒有看出什么差異，那么不妨看看這些NK細(xì)胞的表面特性。他們發(fā)現(xiàn)離體擴(kuò)增的CB-NK細(xì)胞的激活標(biāo)記物表面表達(dá)增加。

擴(kuò)增的CB-NK細(xì)胞顯著上調(diào)活化受體（包括CD69和CD25）以及天然細(xì)胞毒性受體NKp30和NKp44的表面表達(dá)。此外，表達(dá)活化標(biāo)記NKG2D的擴(kuò)增CB-NK細(xì)胞數(shù)量存在增加的趨勢(shì)。

左：體外擴(kuò)增上調(diào)了CB-NK細(xì)胞上激活標(biāo)記物的表面表達(dá)。右：來(lái)自新鮮、短期冷凍保存和長(zhǎng)期冷凍保存臍帶血的體外擴(kuò)增CB-NK細(xì)胞具有相似的激活和成熟標(biāo)記物表達(dá)。

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來(lái)源：Nham T. et?al, 2018

從治療效果上講，擴(kuò)增的CB-NK細(xì)胞通過產(chǎn)生高水平的促炎細(xì)胞因子、干擾素-γ和腫瘤壞死因子-α顯示出有效的抗腫瘤功能。表現(xiàn)出對(duì)三陰性乳腺癌和雌激素受體陽(yáng)性/孕激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者的原發(fā)性乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

左：來(lái)自新鮮、短期冷凍保存和長(zhǎng)期冷凍保存臍帶血擴(kuò)增的CB-NK細(xì)胞在細(xì)胞因子激活時(shí)有效地產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α。右：來(lái)自新鮮、短期冷凍保存和長(zhǎng)期冷凍保存臍帶血擴(kuò)增的CB-NK細(xì)胞對(duì)MDA-MB-231乳腺癌癥細(xì)胞表現(xiàn)出類似的細(xì)胞毒性，并且在細(xì)胞因子激活時(shí)細(xì)胞毒性增加

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來(lái)源：Nham T. et al, 2018

簡(jiǎn)言之，長(zhǎng)期冷凍保存對(duì)擴(kuò)增CB-NK細(xì)胞的擴(kuò)增潛力或效應(yīng)功能沒有影響。因此，研究者們確認(rèn)長(zhǎng)期冷凍保存的臍帶血在臨床上對(duì)于治療性NK細(xì)胞的離體擴(kuò)增仍然有效。

除了臍帶血外，外周血也是NK細(xì)胞的重要來(lái)源。目前開展的許多NK細(xì)胞免疫治療方法就是收集患者PBMC（外周血單核細(xì)胞），淋巴細(xì)胞分離液分離后體外刺激向NK細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增。

為了保證療效，需要多次采集，多次輸注，期間可能遇到患者由于化療導(dǎo)致外周血白細(xì)胞數(shù)量大幅度減少，此時(shí)采集的PBMC很可能無(wú)法發(fā)揮免疫治療的作用，這不僅浪費(fèi)了醫(yī)療成本，而且還增加了患者的負(fù)擔(dān)。

因此，低溫凍存細(xì)胞的技術(shù)可以在一定程度上解決這種困境。那么，從患者采集PBMC，在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)NK細(xì)胞并凍存，之后復(fù)蘇培養(yǎng)再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，這個(gè)思路可以保證治療效果嗎？

來(lái)自徐州醫(yī)科大學(xué)的研究人員及其合作者在《徐州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》發(fā)表了題為“-80℃短期凍存對(duì)NK細(xì)胞功能及殺傷活性的實(shí)驗(yàn)研究”的研究論文，證明了-80℃凍存NK細(xì)胞12周以內(nèi)對(duì)細(xì)胞的功能及殺傷活性沒有影響。

文章首頁(yè)截圖

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首先，他們?nèi)×馨图?xì)胞分離液分離的PBMC（含有未經(jīng)培養(yǎng)的NK細(xì)胞）及培養(yǎng)12天的NK細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果顯示，未經(jīng)培養(yǎng)的NK細(xì)胞表型CD3–CD56+僅占(7．83±1.57)％，而培養(yǎng)12天的NK細(xì)胞表型CD3–CD56+的比例高達(dá)(79.83±2.53)％。

-80℃凍存24周的NK細(xì)胞與未凍存的NK細(xì)胞的表型、活性、顆粒酶B、穿孔素及CD107a表達(dá)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P）。而-80℃凍存12周內(nèi)的NK細(xì)胞與未凍存的NK細(xì)胞各組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P）。

隨后，他們?nèi)龃媲昂蟮腘K細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，復(fù)蘇的食管癌細(xì)胞為靶細(xì)胞，進(jìn)行殺傷活性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，凍存24周的NK細(xì)胞與未凍存NK細(xì)胞的殺傷活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P）。

綜上所述，-80℃凍存12周以內(nèi)的NK細(xì)胞與未凍存的NK細(xì)胞比較，在表型和凋亡百分率方面均無(wú)明顯變化，且細(xì)胞功能及殺傷活性也無(wú)明顯改變。腫瘤患者化療的一個(gè)療程大約為4周，因此-80℃凍存細(xì)胞可以滿足大多數(shù)患者的需要。

對(duì)于需要放化療的患者，選擇合適的窗口期進(jìn)行細(xì)胞采集，培養(yǎng)后在-80℃冰箱中凍存細(xì)胞，3個(gè)月內(nèi)均可選擇合適的時(shí)間復(fù)蘇回輸細(xì)胞，從而保證患者的療效，為腫瘤患者爭(zhēng)取更多免疫治療的機(jī)會(huì)。

文中所述這兩種不同來(lái)源的NK細(xì)胞相比，臍帶血來(lái)源的NK細(xì)胞收集和冷凍保存更加便捷，且長(zhǎng)期冷凍保存對(duì)臍帶血NK細(xì)胞的擴(kuò)增潛能和抗腫瘤活性均沒有影響。但是，外周血NK細(xì)胞（不是PBMC）在短期（12周內(nèi)）凍存是沒有影響的，但再延長(zhǎng)凍存期的話可能會(huì)顯示一定的局限性。

臨床醫(yī)生可以根據(jù)實(shí)際情況，按需選擇不同的細(xì)胞來(lái)源和冷凍方式，為患者受益最大化而努力。