新一代調節性T細胞療法：CAR-Treg

調節性T細胞（Treg）是免疫細胞的一小部分，專門用于抑制過度免疫激活和維持免疫穩態。在過去二十年中，嵌合抗原受體（CAR）的開發和基因組編輯的進展促進了T細胞治療的優化, 這些技術現在被用于增強Treg細胞的特異性和功能性, 以Treg細胞為基礎的自身免疫和移植治療正得到快速的發展。

Treg是T細胞的一個子集， 占CD4+T細胞總數的5-10%，具有維持體內平衡和預防自身免疫的功能，其特征是CD4、CD25、FOXP3和低水平CD127的共同表達。高水平的FOXP3和特異性去甲基化區域（TSDR）的去甲基化是Treg的顯著特征，TSDR是FOXP3基因中的一個保守區域。

Tregs可分為兩類：天然調節性T細胞（nTregs）和誘導調節性T細胞（iTregs）。兩種類型的Tregs都普遍表達 Foxp3。nTregs在胸腺中自然發育，其抑制作用是通過細胞間接觸實現的，它們的主要功能是維持正常的免疫耐受和控制炎癥反應。

iTregs來源于腫瘤微環境信號誘導的外周原始T細胞，包括腫瘤抗原、細胞因子（如IL-10,
TGF-β）和其他可溶性分子。iTregs通過多種促進腫瘤進展的機制抑制效應T細胞（Teff）、NK細胞和DC的抗腫瘤免疫作用。

Tregs主要有以下五種功能機制：①Tregs分泌抑制性細胞因子，包括 IL-10、TGF-β 和 IL-35。②Tregs 通過顆粒酶和穿孔素殺死效應細胞。③ Tregs 影響效應細胞的功能：Treg 與效應T細胞競爭消耗 IL-2，從而抑制效應T細胞的生長；Tregs通過產生胞外酶CD39和CD73 促進TME中腺苷的產生，誘效應細胞導的抑制和抗增殖作用；Tregs通過縫隙連接將大量 cAMP 轉移到效應T細胞，干擾其代謝。④Tregs通過刺激性和抑制性受體（CTLA-4 或 LAG3）誘導DC耐受，后者通過IDO進一步抑制T細胞的能力。⑤MDSCs和Tregs 產生的因子形成正反饋環，促進增殖，增強抑制環境。

此外，一項研究使用一種新的策略來定義Tregs， Th1樣Tregs（T- 234bet+IFNγ+Foxp3+），Th2 樣Tregs（Gata3+IRF4+IL4+Foxp3+）和Th17樣Tregs（IL-17+RORγt+Foxp3+），這為靶向 Tregs 治療提供了新思路。

最初過繼性Treg的臨床試驗主要使用多克隆或體外擴增的Tregs。第一份關于用體外擴增的Treg治療GVHD的報告表明，慢性GVHD患者的癥狀得到緩解，并有可能減少免疫抑制劑的使用。幾年后，11名接受干細胞移植治療惡性血液病的GVHD患者獲得了臍帶血來源的Treg，并進行了擴增和給藥。接受Treg治療的患者II-IV級急性GVHD的發病率降低5倍，Treg治療組一年后無慢性GVHD，而對照組為14%。

雖然多克隆Tregs獲得了一定程度令人鼓舞的效果，但是輸注所需的細胞數量相當大，此外，還有非特異性免疫抑制的風險，事實上，多克隆Tregs輸注后的病毒再激活已有報道。

這些缺點可以通過使用抗原特異性Treg來克服，與多克隆Treg相比，抗原特異性Treg只需要較少的細胞就可以實施更多的局部和靶向抑制。此外，許多研究已經證明，在動物模型中，特異于所需抗原的Treg在功能上優于多克隆或未修飾的Treg。

傳統的產生抗原特異性Treg的方法主要依賴于用APCs和特異性抗原擴增，或用T細胞受體（TCRs）工程化的Treg。然而，用APCs擴增Treg效率低下，而用TCR構建的Tregs（TCR-Tregs）仍然受到MHC的限制，限制了針對不同患者的模塊化應用。

另一種賦予Tregs特異性的方法是用CAR轉導這些細胞。與TCR-Treg相比，CAR具有一些獨特的優勢：這些表達CARs的T細胞激活時繞過HLA限制，通過共受體信號的激活增加了特異性，以及CARs的靶向靈活性（任何可溶性或表面多價抗原都可以作為靶點）。

CAR-Treg細胞最直接的應用是GvHD和器官移植排斥反應。與大多數自身免疫性疾病不同，移植中有非常明確的靶點，即HLA分子。2016年，首次報道了HLA-A2
CAR Treg細胞，研究證明，HLA-A2-CAR-Treg細胞抑制Teff細胞增殖，并在免疫缺陷NSG小鼠模型中阻止了HLA-A2+PBMC介導的GvHD。

GvHD

Treg治療已成為GvHD研究的一個重要領域，大多數研究集中于體外擴增的多克隆Treg。治療GvHD的Tregs的首次臨床試驗顯示，對急性GvHD癥狀的影響不大，但顯著緩解了慢性GvHD的癥狀，并減少了免疫抑制劑的使用。

隨后的研究開始使用CAR-Tregs，這是一種同種抗原特異性人類Tregs，被設計用于表達HLA-A2-特異性CAR。在體外和體內試驗中，這些A2-CAR Treg保持FoxP3、CD25、Helios和CTLA-4的高表達。此外，他們在免疫缺陷小鼠模型中預防了異種GvHD。

繼HLA-A2靶向CAR-Tregs成功后，最近的研究重點是產生具有不同靶向結構域的CAR-Tregs，如CD83，其可在小鼠模型中預防GvHD。還有CD19，其可抑制B細胞抗體的產生和導致GvHD的病理學。

這些有希望的結果促成了在英國和美國對腎移植患者進行的第一次CAR-Treg臨床試驗（NCT04817774）授權。這項試驗可能支持CAR-Tregs在臨床試驗中優于多克隆擴增的Tregs，進一步擴大了在其他疾病條件下使用CAR-Tregs的可能性。其他生物制藥公司緊隨其后，例如Quell Therapeutics，專注于肝移植受者的CAR-Tregs。

糖尿病

1型糖尿病（T1D）是一種自身免疫性疾病，其特征是由于胰腺β細胞的破壞而導致胰島素缺乏。研究表明，T1D患者中Treg的免疫抑制功能降低。在動物模型中，輸注擴增的抗原特異性Treg在阻斷和逆轉糖尿病方面顯示出有希望的結果。然而，由于在循環中罕見，分離足夠多的抗原特異性Treg具有挑戰性。

因此，研究重點是用FoxP3基因轉導的多克隆CD4+T細胞，將其轉化為Treg。此外，可通過工程化TCR或CAR技術將抗原特異性賦予多克隆T細胞。Brusko的研究小組發現，谷氨酸脫羧酶（GAD）特異性TCR轉導的Treg在體外可以抑制抗原特異性T細胞增殖的能力。另一項研究中，Hull等人將胰島特異性TCR轉移到調節性T細胞，并證實其在體外具有抑制CD4和CD8 T細胞增殖的能力。目前，GentiBio和Abata等公司正在開發TCR工程化Treg治療T1D。

類風濕性關節炎

類風濕性關節炎（RA）是最常見的炎性關節炎，其特征是滑膜炎癥、增生、自身抗體產生、軟骨和骨破壞。多種免疫細胞亞群參與RA的發展，其中，T細胞和巨噬細胞之間的相互作用起著至關重要的作用。

許多研究調查了增加Treg數量或改善Treg功能對RA的益處。Wright等人利用卵清蛋白（OVA）特異性Treg，通過產生TCR轉導的Treg或TCR-FoxP3轉導的CD4+T細胞，來抑制OVA誘導的關節炎。兩種工程化Treg均通過旁觀者抑制對不同抗原特異性T細胞的增殖表現出OVA依賴性的抑制。目前，Sonoma Biotherapeutics公司正在開發針對RA的CAR Treg療法。

多發性硬化癥

多發性硬化（MS）是一種自身免疫性脫髓鞘和神經退行性疾病，由識別髓鞘表位的自身反應性T細胞引起。使用實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型進行的臨床前研究證實了Tregs抑制抗原特異性自身反應性免疫反應的有效性。

Fransson等人用CAR靶向髓鞘少突膠質細胞糖蛋白（MOG）創建抗原特異性Treg。MOG-CAR
Tregs在體外抑制了效應T細胞的增殖。在體內，MOG-CAR
Tregs減少了EAE小鼠的疾病癥狀，并減少了腦組織中的促炎細胞因子mRNA水平。后來，Kim等人利用源自MS患者的髓鞘堿性蛋白特異性TCR構建了Treg，在體內TCR-Tregs顯著降低了EAE-MS小鼠模型中的疾病評分。免疫調節工程化Treg在臨床前研究中的結果，促進了一些生物制藥公司的CAR-Treg的開發，如Abata Therapeutics和TeraImmune。

炎癥性腸病

炎癥性腸病（IBD）是以胃腸道慢性炎癥為特征的疾病，潰瘍性結腸炎（UC）和克羅恩病（CD）是IBD最常見的形式。研究表明，腸道微生物群和免疫反應之間的不平衡在IBD中起著重要作用。通常，腸道炎癥與Treg數量的減少無關。然而，Treg活性不足的小鼠更容易發生嚴重結腸炎。因此，多項研究試圖利用Treg抑制活性來維持UC的耐受性。

在一項研究中，來自轉基因小鼠的針對已知結腸炎抗原（TNP）的CAR-Tregs在體外抑制了效應T細胞的增殖。在體內，誘導結腸炎后，與野生型動物相比，觀察到CAR-Treg轉基因小鼠的存活率增加。此外，將TNP-CAR Tregs轉移到結腸炎小鼠模型中可以減少癥狀并提高存活率。基于CAR-Treg細胞的治療可能是緩解UC和CD的一種有前途的有效方式。

哮喘

哮喘是一種慢性呼吸道疾病，哮喘患者的Treg受損并減少。因此，新方法專注于通過在哮喘臨床前模型中轉移調節性T細胞來預防氣道炎癥。此外，一項研究利用調節T細胞表位（Tregitopes）誘導高度抑制性過敏原特異性Treg。

用Tregitopes治療可抑制過敏原誘導的氣道高反應性和肺部炎癥。為了將Treg導向哮喘相關抗原，Skuljec等人應用CAR技術，從轉基因小鼠中分離出針對CEA的第二代Treg，CEA是一種存在于肺和胃腸道腺上皮表面的糖蛋白。他們的結果顯示了哮喘小鼠炎癥肺中CEA-CAR Tregs的激活和歸巢。此外，與未修飾的Tregs相比，CEA-CAR Tregs在更大程度上改善了炎癥。

合成生物學

開發Treg細胞作為治療自身免疫性疾病的藥物并不僅局限于TCRs和CARs的應用，合成免疫學已經產生了許多人工受體和系統，正在Treg細胞中進行測試。

這些系統包括通過連接的單鏈抗體將內源性TCR復合物招募到非MHC靶點的T細胞抗原偶聯劑，可以被可溶性配體結合并激活的CARs，以及可分開的、通用和可編程的CAR（SUPRA）。

細胞因子

毫無疑問，細胞因子在免疫反應中起著關鍵作用。Treg細胞組成性地表達IL-2受體的高親和鏈CD25，有效地剝奪Teff細胞的IL-2。此外，通過工程化CAR-Treg細胞的改造，可以將促炎細胞因子信號轉化為IL-2或IL-10信號以增加對炎癥的抑制。

一些利用CRISPR–Cas9編輯人類T細胞基因的臨床前研究已有發表，這些包括敲除CD4+T細胞中CCR5的基因，產生抗HIV感染的T細胞；敲除CD7-CAR T細胞中CD7的基因，因為T細胞本身表達CD7，從而防止自相殘殺；以及敲除CD19-CAR T細胞中PD1的基因，從而提高人源化小鼠模型的腫瘤清除率。

目前，CAR T細胞的制造使用逆轉錄病毒和慢病毒轉導將遺傳物質傳遞并整合到T細胞中。然而這些方法費時、昂貴且有安全問題的困擾。

目前，利用Treg細胞設計治療自身免疫疾病正方興未艾，工程化CAR-Treg在這方面表現出獨特的優勢，具有極大的潛力。然而，在Treg細胞生物學和Treg細胞治療領域仍存在許多問題。

在接下來的十年中，隨著這些懸而未決的問題的解決，期待看到Treg細胞制造的持續改進，以及與合成生物學和基因編輯的廣泛應用，將使Treg細胞療法發揮出越來越重要的作用。

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