間充質(zhì)干細(xì)胞分泌組在皮膚病領(lǐng)域的重要作用

分泌組（Secretome或分泌蛋白質(zhì)組），也稱為條件培養(yǎng)基，是間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs) 的分泌分子，具有多種生物活性，可用于各種治療，尤其是皮膚應(yīng)用。MSCs分泌組中生長因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外囊泡（包括微囊泡和外泌體）的存在已被廣泛報道，其有助于改善細(xì)胞的增殖和遷移，幫助皮膚再生，MSCs分泌組能夠解決多種皮膚問題。MSCs分泌組具有多種有用的活性來再生和修復(fù)尚未在皮膚上使用的組織損傷，例如用于傷口愈合、光保護(hù)、促進(jìn)毛發(fā)生長、牛皮癬治療和其他應(yīng)用作為抗菌劑。

間充質(zhì)干細(xì)胞分泌組在皮膚病領(lǐng)域的應(yīng)用

皮膚是身體最大的器官，是抵御各種疾病和外部刺激的第一道防線，容易引起感染和炎癥。經(jīng)常發(fā)現(xiàn)各種皮膚問題，從急性到慢性皮膚病，會損害結(jié)構(gòu)和功能引發(fā)皮膚的各種反應(yīng)。對于慢性皮膚病，如感染、炎癥、紫外線（UV）暴露等，一般治療無法在正常情況下恢復(fù)受損皮膚組織的功能和結(jié)構(gòu)。因此，引發(fā)了更有效療法的開發(fā)。

干細(xì)胞療法的發(fā)展一直持續(xù)到今天，尤其是在皮膚病療法方面。干細(xì)胞，尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs)，可以分泌負(fù)責(zé)組織再生和修復(fù)組織損傷的營養(yǎng)因子。然而，這種使用 MSCs 的療法在移植過程、細(xì)胞保留和如果干細(xì)胞發(fā)生突變，則可能導(dǎo)致癌癥。MSCs 的主要作用機(jī)制與分泌體分泌的重要因子的旁分泌作用有關(guān)。由于對基于分泌組分泌的 MSC 工作的認(rèn)識，它可以用作克服與使用活細(xì)胞相關(guān)的問題的替代方法。

MSCs分泌組是 MSC 在條件培養(yǎng)基中分泌的一種生物活性分子。它含有大量的生長因子、細(xì)胞因子和各種大分子和細(xì)胞外囊泡，包括微泡和外泌體，可以刺激各種生物反應(yīng)，特別是在調(diào)節(jié)各種新組織形成方面。這些因素在細(xì)胞之間的通訊中起著重要作用并參與各種生理過程，包括提供生物反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

使用分泌組的療法可以解決與活細(xì)胞使用問題相關(guān)的挑戰(zhàn)。分泌組再生和修復(fù)受損組織的能力使其成為與處理各種皮膚問題相關(guān)的替代方案之一，這些問題已在各種研究中得到廣泛報道。

間充質(zhì)干細(xì)胞分泌組用于皮膚應(yīng)用的用途

分泌組

分離和分泌組培養(yǎng)

分離是獲得分泌組的第一步。MSCs 的分泌組可以從各種成人組織中分離出來，包括脊髓、脂肪組織、皮膚組織、外周血和新生兒組織，如臍帶、羊膜和胎盤。在分離過程之后，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，使用含有 10% 胎牛血清 (FBS) 的 培養(yǎng)基 (DMEM) 在 37°C 的溫度下將分離的細(xì)胞培養(yǎng) 5 小時，以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。提供細(xì)胞營養(yǎng)需求和 250 U/mL 1 型膠原酶。然后用 40 μm 濾網(wǎng)細(xì)胞過濾，然后種植在生長培養(yǎng)基中（即培養(yǎng)基 EBM-2 內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)生長，并在 37 °C 和 5%CO2）。

分泌組的制備

當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 80-90% 匯合時進(jìn)行分泌組制備，然后用 PBS 洗滌兩次并在 DMEM（不含 FBS 和抗生素）中孵育。培養(yǎng)48小時后收集條件培養(yǎng)基或分泌組，1500rpm離心3分鐘兩次，然后用0.45μm注射器過濾器過濾以去除碎片和死細(xì)胞。在用于測試之前，將獲得的條件培養(yǎng)基儲存在 -80°C 下。

在某些情況下，由于培養(yǎng)基中生物活性因子的濃度較低以產(chǎn)生治療效果，因此有幾種方法用于增加這些因子的分泌，即在缺氧條件下培養(yǎng)和在兩(2D) 或三維 (3D) 基質(zhì)。在體外缺氧條件下培養(yǎng) MSCs 可以增加角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞的增殖和遷移作用，這與血管生成因子如 VEGF 和 bFGF 的上調(diào)有關(guān)，以及與常氧相比，膠原蛋白生成增加。

研究發(fā)現(xiàn)，缺氧培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)水平比正常培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)水平高 15 倍。在 3D 培養(yǎng)中，與傷口閉合成功相關(guān)的再上皮化增加，如與正常培養(yǎng)物相比。為了鑒定分泌組中包含的各種蛋白質(zhì)，需要分析技術(shù)。進(jìn)行分析技術(shù)以鑒定包含在分泌組中的各種蛋白質(zhì)。通常使用常規(guī) ELISA 方法和多重方法。這些方法可以識別分泌組中包含的許多蛋白質(zhì)，例如生長因子和細(xì)胞因子。研究表明，分泌組中有 28 種蛋白質(zhì)分析物BM。分泌組中生長因子（例如 VEGF 和 TGF-β）的存在對皮膚健康起著重要作用。

分泌組對皮膚應(yīng)用的作用

眾所周知，分泌組在治療各種疾病方面具有多種益處。發(fā)揮作用的主要因素是分泌的蛋白質(zhì)，它可以幫助修復(fù)和再生受損組織。間充質(zhì)干細(xì)胞的分泌組作為治療各種皮膚問題的治療劑發(fā)揮著重要作用。

傷口愈合

傷口愈合是身體修復(fù)和再生受損組織的自然過程，包括三個主要階段——炎癥、增殖和重塑，這些階段重疊發(fā)生。傷口愈合仍然是臨床管理治療問題中的一個挑戰(zhàn)，尤其是在慢性病中。使用分泌組作為處理皮膚損傷的替代療法已被廣泛報道，包括加速傷口閉合。各種評估分泌組益處的研究已經(jīng)在體外和體內(nèi)完成了傷口愈合。體外測試通常通過觀察細(xì)胞的遷移和增殖能力來完成?；诩?xì)胞模型的使用已使用不同類型皮膚細(xì)胞的成分進(jìn)行測試，例如人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞 (HaCaTs)、人真皮成纖維細(xì)胞 (HDF)、人包皮成纖維細(xì)胞 (HFF)、人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞 (HDMEC) )和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC)?？梢允褂眠w移測定法和/或淀粉測定法確定細(xì)胞遷移能力。通過比較對照組和治療組之間傷口閉合的速度來進(jìn)行該測試。為了確認(rèn)細(xì)胞遷移的影響，也可以通過鑒定 MMP2 和 MMP9 的表達(dá)水平來完成，這兩者都參與了細(xì)胞的遷移過程。細(xì)胞的增殖能力可以使用測定增殖方法進(jìn)行管理， WST-1 測定和 MTT 測定。該測試旨在查看分泌組給藥后細(xì)胞的活力是否增加。另一種支持方法也可以通過使用血管生成測定觀察血管生成的能力來完成。

來自各種不同來源（如骨髓、脂肪組織、新生兒組織、皮膚組織和外周血）的分泌組已被證明可以提高各種真皮細(xì)胞的遷移能力，如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞，以及表皮能夠在體外刺激這些細(xì)胞的增殖。研究還表明，根據(jù)細(xì)胞劃痕測試結(jié)果，來自臍帶組織的分泌組能夠增加 HDF 和 HaCaT 細(xì)胞遷移。研究還指出，通過使用分泌組和 MTT 測定方法處理，參與細(xì)胞增殖的 ki67 標(biāo)志物的表達(dá)增加。使用分泌組還能夠根據(jù)體外血管生成測試以及遷移調(diào)節(jié)管形成和增殖 HUVECs。傷口愈合速度可歸因于 MSCs 的營養(yǎng)作用，影響真皮成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞。

體內(nèi)實驗動物模型可以以小鼠、大鼠和豬的形式使用。該方法已經(jīng)在各種情況的動物模型上進(jìn)行了測試，例如慢性傷口、燒傷、糖尿病足潰瘍、皮膚潰瘍和輻射傷口，需要特殊處理人員。結(jié)果表明，用分泌蛋白組處理傷口能夠通過增加細(xì)胞遷移和增殖的作用并觸發(fā)血管生成、上皮再形成、新血管形成和膠原蛋白沉積來加速傷口愈合，這些在傷口愈合過程中發(fā)揮作用。ADSC 中的分泌組成分，如核心蛋白聚糖 (Dcn) 和生腱蛋白 (Tnc) 在表皮生長因子受體 (EGFR) 調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

光保護(hù)

紫外線 (UV) 輻射會導(dǎo)致一些皮膚問題，尤其是光老化。光老化是由過度的紫外線照射引起的皮膚老化，它會導(dǎo)致皮膚的形態(tài)和生理變化，例如出現(xiàn)皺紋和皮膚彈性降低。已經(jīng)報道了將分泌組作為一種療法來防止光老化影響的研究。使用了皮膚細(xì)胞、HDFs 和 HaCaTs 的幾種體外模型，這兩種細(xì)胞都是對 UVB 輻射產(chǎn)生的防御作用的細(xì)胞。紫外線輻射會抑制細(xì)胞增殖率，減少膠原蛋白 I、膠原蛋白 III 和彈性蛋白由于 mRNA 表達(dá)下調(diào)。紫外線輻射還可以導(dǎo)致 MMP1 和 MMP9 水平升高，從而抑制原膠原的合成并觸發(fā)各種信號通路的激活，即絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)、蛋白激活劑 1 (AP- 1）和核因子κB（NF-κB），由于ROS的形成而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，并可以觸發(fā)皮膚細(xì)胞的凋亡，從而抑制皮膚再生并能夠?qū)琴|(zhì)形成細(xì)胞造成DNA損傷。

已經(jīng)進(jìn)行了各種研究來研究分泌組作為抗光老化劑的作用。通過各種方法進(jìn)行體外測試。使用的方法觀察細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞衰老和細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi) ROS 水平和嘧啶環(huán)丁烷二聚體測定 (CPD)。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖增加來自脂肪干細(xì)胞 (ADSC-CM) 的使用，以及 HDF 中經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞數(shù)量減少和細(xì)胞衰老減少。還發(fā)現(xiàn) ADSC-CM 可以減少細(xì)胞死亡的數(shù)量從細(xì)胞凋亡（以亞 G1 期減少為特征）和增加膠原蛋白 I 合成，以及抑制 HDF 中 MMP1 的產(chǎn)生。使用相同的亞 GI 測定方法，還報告了減少用人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞 (hUCB-MSC-CM) 構(gòu)象 5%、10% 和 20% 處理后的細(xì)胞凋亡百分比分別從 94.2% 到 46.8%、31.8% 和 31.5%。分泌組能夠使用 DCFDA 熒光降低細(xì)胞內(nèi) ROS 水平cent 測定，以及能夠增加細(xì)胞遷移并降低體外 CPD 的形成水平。

ADSCs的分泌組具有提供光保護(hù)的作用。這與發(fā)揮作用的生物因子的含量有關(guān)，尤其是血小板衍生生長因子 AA (PDGF-AA)，它可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和重塑。這種作用也與 TGF-AA 的含量有關(guān)。分泌組中的 β1，可刺激 mRNA 表達(dá)并增加膠原蛋白生成。該機(jī)制還與 Wnt/β-catenin 信號通路中 wnt3a 和 catenin 的表達(dá)上調(diào)有關(guān)，這與 TGF-β2 的表達(dá)增加有關(guān)。這對于 I 型原膠原的合成很重要）

對測試動物（通常是裸鼠）進(jìn)行的其他測試與 UVB 暴露有關(guān)。結(jié)果表明，在宏觀使用分泌組后通過改善皮膚水合作用減少皺紋和皮膚窘迫，并根據(jù)馬森三色分析增加膠原蛋白合成。

在一些研究中，據(jù)報道，分泌蛋白組可以用作化妝品中的活性成分，提醒我們它對皮膚再生的好處。通常，研究利用分泌組作為皮膚護(hù)理療法來預(yù)防各種老化因素，包括光老化。研究人員將分泌體配制為半固體血清制劑形式的抗衰老化妝品，使用以下劑量為 0.25%、0.5% 和 1%。類似研究利用分泌體作為原料制造用氣刷涂抹的化妝品，分泌物濃度高達(dá)5%。結(jié)果顯示測試參數(shù)減少，如皺紋，皮膚水分增加。同樣，研究人員也使用分泌素作為乳霜制劑形式的化妝品原料。使用的分泌組濃度為 1%，在 3D 培養(yǎng)中繪制輪廓。使用分泌組可以增加膠原蛋白的合成，并通過改善皮膚彈性來減少衰老。

頭發(fā)生長

脫發(fā)是一個術(shù)語，用于描述由各種因素引起的頭皮異常引起的禿頂或脫發(fā)狀況。這種狀況會導(dǎo)致頭發(fā)生長的活躍階段（生長期）受到抑制，而其余階段（休止期）在頭發(fā)生長周期中變得更快。

因此，很多研究都集中在了解頭發(fā)生長周期上。各種研究報告了分泌組療法對頭發(fā)生長的影響。通常進(jìn)行體外測試以確定毛細(xì)胞的增殖能力。使用人毛囊的人乳頭細(xì)胞 (HFDPC)、外根鞘細(xì)胞 (ORC) 和人上皮角質(zhì)形成細(xì)胞 (HEK)，是位于毛囊中的細(xì)胞類型，可通過相互交流刺激毛發(fā)生長和再生上皮細(xì)胞的過程。

研究人員使用真皮乳頭細(xì)胞 (DPC) 的分泌組研究了可能參與毛囊再生的旁分泌因子。結(jié)果表明，利用DPCs分泌組3代分泌大量CXCL12、MMP3和雙糖鏈蛋白聚糖，對Wnt/β-catenin信號線的激活以及LTBP1.63激活發(fā)揮作用。已知該途徑可觸發(fā)毛囊細(xì)胞的增殖。分泌組的使用能夠觸發(fā) HFDPC 和 ORC 的增殖，加速休止期到生長期，離體可誘導(dǎo)毛發(fā)基質(zhì)的增殖。在使用小鼠 C3H/HeN 形式的動物模型的應(yīng)用中，分泌組能夠誘導(dǎo)毛囊生長。

銀屑病

銀屑病是一種皮膚慢性炎癥，會導(dǎo)致白細(xì)胞介素 (IL-17) 的表達(dá)水平升高。在銀屑病中，朗格漢斯細(xì)胞代表表皮細(xì)胞遷移障礙，作為與 T 細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)的免疫反應(yīng)，特別是 Th17 介導(dǎo)的。這種情況還會導(dǎo)致細(xì)胞因子產(chǎn)生異常，從而導(dǎo)致表皮增生以及異常角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞凋亡 (KCs)。銀屑病的特征是皮膚和指甲上出現(xiàn)帶有厚厚白色鱗屑的斑塊或皮疹。

已經(jīng)進(jìn)行了關(guān)于分泌組治療銀屑病的研究。銀屑病建模可以使用咪喹莫特和 Wistar 大鼠模型。咪喹莫特會引起炎癥，其特征是存在粗糙的薄片和表皮脫落。與對照組相比，分泌組的使用能夠更好地減少因使用咪喹莫特 (IMQ) 引起的炎癥影響。外泌體 (分泌組) 能夠通過抑制 IMQ 大鼠模型的成熟和降低銀屑病評分。HaCaTs 中樹突細(xì)胞 (DC) 和 IL-17 的激活。局部給藥的脂肪組織分泌組顯示患者頭皮上的紅斑斑塊和銀鱗的數(shù)量顯著減少分泌組給藥 2 周后消失，給藥 1 個月后消失。

其他應(yīng)用

據(jù)報道，分泌組具有抗菌活性?？咕鷦┦且环N可以抑制或抑制微生物生長的化合物。對微生物產(chǎn)生耐藥性的各種藥物不斷增加。使用分泌組可以是防止耐藥性的替代方法之一。在一些研究中，分泌組已知會釋放抗菌肽，例如導(dǎo)管素 LL-37、鈣衛(wèi)蛋白、鐵調(diào)素、RNase3、lipocalin-2 和人類 β-防御素。脂肪組織的分泌組能夠抑制 S . aureus 通過增加 cathelicidin 的活性。研究人員研究了分泌物對皮膚傷口中細(xì)菌的抗菌作用，使用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行了測試。結(jié)果表明，使用分泌組可以抑制革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性大腸桿菌的生長，產(chǎn)生影響細(xì)菌膜的分泌因子。

結(jié)論

分泌組（Secretome） 是一種由間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的生物活性因子，作為各種再生性疾病的治療劑，對皮膚具有多種益處。對分泌組用于皮膚應(yīng)用和配方開發(fā)的研究仍然非常有限。幾項研究報告稱，從 MSCs 獲得分泌組的過程是通過從各種成體組織中分離出來并在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。培養(yǎng)過程會影響所得因子的表達(dá)水平。皮膚分泌組的應(yīng)用包括傷口愈合、光保護(hù)、促進(jìn)毛發(fā)生長、牛皮癬治療和其他作為抗菌劑的應(yīng)用?？紤]到分泌組的各種成分，它在各種疾病中具有很大的潛力，需要發(fā)展和更深入的研究才能最大限度地利用。

參考文獻(xiàn)：

Robert AW, Azevedo Gomes F, Rode MP, et al. The skin regeneration potential of a pro-angiogenic secretome from human skin-derived multipotent stromal cells.?J Tissue Eng. 2019;10:2041731419833391.