科羅拉多大學 | 誘導多能干細胞（iPSC) 在皮膚科中的應用

本文作者Ganna Bilousova and Dennis R. Roop來自科羅拉多大學安舒茨醫學院皮膚科，原文標題為Induced Pluripotent Stem Cells in Dermatology: Potentials, Advances, and Limitations（皮膚病學中的誘導多能干細胞：潛力、進展和局限），發表刊物為Cold Spring Harb Perspect Med(NML）.

| 科羅拉多大學

將成年體細胞重編程為誘導多能干細胞 (iPSC) 的方法的發現提高了為多種疾病提供真正個性化治療選擇的可能性。與胚胎干細胞 (ESCs) 類似，iPSCs 可以在體內產生任何細胞類型，并且可以通過同源重組進行基因校正。

iPSC 的這些 ESC 特性允許為許多目前無法治愈的疾病（包括遺傳性皮膚病）開發永久性矯正療法，而無需使用胚胎組織或卵母細胞。在這里，我們回顧了 iPSC 研究的最新進展和局限性，重點關注 iPSC 的臨床應用以及使用 iPSC 模擬人類疾病以在皮膚病學領域發現藥物。

基本上所有最具破壞性的遺傳性皮膚病形式，例如大皰性表皮松解癥 (EB) 亞型和先天性魚鱗病都是由已知的單基因缺陷引起的，理論上應該使他們能夠在基因水平上進行校正。

在源自患有皮膚病的患者的 iPSCs 中實現的校正可以隨后將這些校正的 iPSCs 分化為自體皮膚細胞用于移植。除了遺傳性皮膚病之外，iPSC 技術還可能適用于傷口愈合、脫色障礙和美容皮膚病學。

基于 iPSC 的遺傳性皮膚病療法的成功開發取決于四個重要步驟（圖 1）。首先，細胞需要從患者的皮膚活檢中分離出來。其次，這些細胞必須重新編程為 iPSC。第三，生成的 iPSC 中的遺傳缺陷需要通過安全的方法進行糾正，優先通過同源重組 (HR)。第四，這些經過基因校正的患者特異性多能細胞必須分化成與其疾病相關的細胞類型，然后作為自體移植物移植到同一患者身上。未校正的 iPSC 也可用作疾病相關的患者特異性細胞來源，用于體外疾病建模和體內異種移植建模，這將為對疾病機制和藥物發現產生新的見解提供平臺。

圖 1

iPSC 的皮膚病學應用。iPSCs 的產生允許開發干細胞替代策略來治療遺傳性皮膚病和對這些疾病進行建模，目標是為患者提供新的治療選擇。最初，需要從患有遺傳性皮膚病的患者的皮膚活檢中分離細胞。適合重編程的細胞類型是角質形成細胞、黑素細胞和成纖維細胞。在重編程期間，細胞獲得 ESC 特性并經歷“再生”，這可以通過端粒的延長和線粒體功能的恢復來確定。然后可以通過 HR 對生成的 iPSC 進行基因校正。校正后的 iPSC 克隆可以分化成相關的細胞類型進行移植，并作為自體移植物返回給患者。或者，未校正的 iPSC 可以分化為與感興趣的疾病相關的細胞類型，用于在器官培養物中模擬疾病或通過移植到免疫缺陷小鼠作為異種移植物在體內重現疾病表型。

重編程遺傳性皮膚病患者的細胞

只要 iPSC 可以分化成相關的細胞類型，遺傳疾病患者產生的 iPSC 系就可以為研究提供無限的細胞供應和修復基因缺陷的機會。迄今為止，人類 iPSC 已針對多種遺傳性皮膚病產生，包括 VII 型膠原蛋白 (Col7) 缺陷型隱性營養不良性大皰性表皮松解癥 (RDEB)、LAMB3 基因缺陷型交界性大皰性表皮松解癥(JEB), p63 突變外指、外胚層發育不良和唇裂/腭裂 (EEC) 綜合征, 表皮松解性角化過度與顯性 N188S 角蛋白 1 突變和具有顯性 R125C 角蛋白 14 突變的單純性大皰性表皮松解癥 (EBS) 。

此外，iPSCs 已從患有先天性角化不良 (DC) 的患者中獲得，這是一種端粒維持疾病，表現為多器官衰竭、癌癥和與年齡相關的皮膚表型，如指甲角化不良、傷口愈合延遲和脫發。

還嘗試糾正由皮膚病產生的 iPSC 中的缺陷。研究人員使用一種 LAMB3 編碼慢病毒被用于糾正源自 JEB-iPSC 的角質形成細胞，COL7A1 基因缺陷型 RDEB-iPSCs 的瞬時基因校正是通過轉染編碼野生型人類 COL7 基因的表達質粒來實現的。“校正”的 RDEB-iPSC 通過畸胎瘤形成分化成類似于皮膚和造血譜系細胞的結構。同源骨髓間充質細胞先前已被證明可以移植到皮膚中，再生受損的上皮細胞，并在 RDEB 患者和小鼠模型的起泡區域恢復 Col7 的產生。因此，經過校正的 iPSC 可以提供無限的表皮和間充質譜系自體細胞來源，用于治療 RDEB 和潛在的其他皮膚水皰疾病。

iPSCs 分化為皮膚細胞

將 iPSC 分化為相關細胞類型的能力是成功開發基于 iPSC 的治療策略的重要先決條件。最近從 iPSC 中獲得了角質形成細胞、黑素細胞和成纖維細胞。通過依次應用視黃酸和骨形態發生蛋白 4 (BMP4)，小鼠和人類 iPSC 已分化為角質形成細胞。當用小鼠成纖維細胞移植到無胸腺裸鼠上時，小鼠 iPSC 衍生的角質形成細胞顯示形成表皮和皮膚附件，而人類 iPSC 衍生的角質形成細胞能夠在培養中建立功能性器官皮膚。角質形成細胞也由 RDEB-iPSCs、JEB-iPSCs、EEC-iPSCs和 EBS-iPSCs 產生并顯示在體外生長時概括了相應疾病的表型。通過向培養物中補充 Wnt3a、干細胞因子和內皮素-3，黑素細胞可以從 iPSC 中獲得，而用 EGF 和 BMP4 處理 iPSC 培養物可以產生成纖維細胞。雖然現在存在將 iPSC 分化為主要皮膚細胞類型的方案，但尚未進行嚴格的研究來確定這些 iPSC 衍生細胞是否與其正常皮膚等價物相同。

定制基因矯正療法

目前用于將基因轉移到體細胞皮膚細胞中的技術受到許多限制。最大的障礙之一是安全載體的可用性，這些載體能夠產生持久的治療效果，并且插入誘變的風險低。基于質粒和腺病毒載體的基因遞送方法在誘導角質形成細胞的長期矯正效果方面效率低下，并且與生物安全問題相關。因此，通過 HR 進行的基因矯正療法可能是遺傳性皮膚病的唯一永久治愈方法，特別是對于那些涉及隱性功能喪失突變的疾病，如 JEB 和 RDEB 中發生的那樣。因為駐留在增殖性基底層中的成體干細胞不斷更新表皮，所以任何永久性遺傳校正都必須針對該干細胞群。然而，迄今為止，還沒有人報道成功使用 HR 技術來糾正人類角質形成細胞干細胞中的缺陷基因。Mavilio 等人進行了唯一成功的對水皰疾病進行永久性基因校正的臨床試驗，在這種情況下是 JEB，并使用逆轉錄病毒載體恢復層粘連蛋白 322 的表達。由于使用逆轉錄病毒載體的安全問題，該試驗被擱置。

有幾種方法可以誘導 HR，這些方法可以與 iPSC 的產生相結合，以實現遺傳性皮膚病的基因修復。可以使用由核酸酶結構域和單獨的、定制的 DNA 識別結構域組成的嵌合分子來實現 iPSC 中的增強 HR。這些嵌合分子可以在特定的 DNA 序列中引入雙鏈斷裂 (DSB)。攜帶正確基因序列和與 DSB 側翼序列同源性的外源供體 DNA 的存在觸發 HR 并用校正的基因替換有缺陷的基因。

鋅指核酸酶 (ZFNs)和轉錄激活因子樣效應核酸酶 (TALENs)是能夠將特定 DSB 引入基因組 DNA 并廣泛用作研究和基因治療工具的嵌合核酸內切酶的主要代表。除了 ZFN 和 TALEN 之外，最近還采用了一種基于核酸酶的新型技術來實現人類 iPSC 中的基因組編輯。

該技術使用 II 型原核 CRISPR（成簇的規則間隔的短回文重復序列）/CRISPR 相關 (Cas) 系統，當由短 RNA 指導時，可以高效地在內源基因組位點誘導精確切割。基于 ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas 的基因修飾策略已成功用于人和小鼠 ESC 和 iPSC。此外，奧斯本等人最近的一項研究，示了在個性化基因組編輯策略中使用嵌合核酸內切酶治療遺傳性皮膚病的潛力。使用 TALEN，研究人員對從 RDEB 患者分離的原代成纖維細胞中的 COL7A1 基因突變進行了特定的雜合校正。然后使用這些校正的成纖維細胞生成適合分化為校正的自體角質形成細胞的 iPSC。Osborn 等人的原理驗證研究，提供了一組重要的數據，這些數據值得進一步研究基于核酸酶的基因組編輯方法在遺傳性皮膚病矯正中的適用性。

細胞重編程組織再生的潛力

iPSC 的產生與基因靶向相結合可以解決與體細胞基因校正相關的許多障礙。與體細胞不同，iPSC 可以無限擴增，從而更容易選擇和擴增校正的克隆。此外，重編程過程導致完全有能力的細胞“恢復活力”，如衰老途徑的下調、端粒的延長和線粒體功能的恢復所示。報告表明 iPSCs 可以來自非常年老的患者，并且這些 iPSCs 可以分化為在端粒長度和線粒體功能方面表現出“再生”表型的成纖維細胞。重編程還恢復了源自常染色體顯性 DC 患者的細胞中的端粒長度，這是由端粒酶 TERT 的催化蛋白成分的雜合突變引起的，有望為這些患者帶來新的治療益處。

因此，重編程可能是組織再生的關鍵，并提供對衰老和長壽機制的見解。雖然現在很清楚來自老年患者的細胞可以重新編程，但仍需要更多的研究來更好地了解年齡如何影響 iPSC 質量，以及重新編程的“恢復活力”特性如何用于逆轉皮膚老化和改善干細胞的結果——皮膚病的基礎療法。作為一個特定的例子，從患有遺傳性皮膚病的患者中產生 iPSC 可能會提供“再生”的成人皮膚干細胞的來源，這些干細胞很可能由于修復起泡組織的失敗嘗試而耗盡。在使用基因校正的角質形成細胞干細胞治療 JEB 患者的報道中，角質形成細胞干細胞的耗竭尤為明顯。此外，重編程的“恢復活力”特性可能適用于治療老年人的慢性傷口，為移植提供自體的、類似年輕的皮膚細胞。

回復馬賽克作為自然基因療法

盡管 ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas 系統可以顯著提高 iPSC 中基因校正的效率，但需要進行廣泛的基因分析，以消除如果 iPSC 使用這些方法進行基因校正時可能發生的脫靶事件的擔憂。自然發生的體細胞逆轉可能提供適合移植的基因校正細胞的替代來源。

在許多人類遺傳疾病中觀察到遺傳突變的“自然”體細胞逆轉，例如范可尼貧血、Bloom 綜合征、Wiskott-Aldrich 綜合征，如以及遺傳性皮膚病。有許多關于遺傳性皮膚病患者的回復性嵌合體的報道，包括 RDEB、JEB 、EBS ?和五彩紙屑魚鱗病。回復性嵌合體表現為遺傳性皮膚病患者的正常皮膚斑塊。這些斑塊代表具有獲得性繼發性突變的細胞的克隆生長，這些突變抵消了原發性突變的影響并逆轉了疾病的表型。幾種機制負責回復細胞中的第二次“糾正”基因事件，包括基因轉換、第二位點突變、基因內交叉等。因此，在 RDEB 或 JEB 等疾病中從自發回復的皮膚細胞生成 iPSC 可為細胞替代療法提供無限量的自然校正細胞。

用于疾病建模的 iPSC

盡管皮膚細胞可以很容易地從患者的活組織檢查中分離、擴增并用于在器官培養中模擬遺傳性皮膚病，但它們的短壽命限制了它們在體外研究中的適用性。體細胞系的永生化依賴于癌基因的組成型表達，這可能會極大地影響感興趣的細胞類型的表型。

iPSC 技術提供了可再生的患者特異性細胞來源，這些細胞隨后分化為相關細胞類型，可用于生成患者特異性器官或體內異種移植模型。源自疾病特異性 iPSCs 的皮膚細胞在 3D 培養物中保持其表型，如 RDEB-iPSCs 分化為角質形成細胞所示，并且對于皮膚生物學和遺傳皮膚的許多方面的研究可能是無價的疾病。基因操縱 iPSC 的能力也將允許通過相關基因的靶向誘變而不使用 ESC 來模擬皮膚病。這對于建模罕見的遺傳性皮膚病（如 RDEB、EBS 和 JEB）可能特別重要。全球這些疾病的低發病率限制了研究數據的積累，并阻礙了為這些皮膚病制定治療策略的進展。

由于易于接觸，皮膚是測試再生醫學新概念的有吸引力的器官，基于 iPSC 治療遺傳性皮膚病的治療策略就是一個很好的例子。iPSC 在生成平臺以更好地了解疾病機制、藥物篩選以及最終基于 iPSC 的治療方法方面的潛力是巨大的，并為真正的個性化醫療提供了可能性。iPSCs 不僅可以消除從受精的人類胚胎中產生 ESCs 的需要，而且還可以避免同種異體細胞移植過程中不可避免的免疫反應的并發癥。盡管仍處于年輕階段，但 iPSC 領域正在獲得發展勢頭，它有望改變我們治療遺傳性皮膚病患者的方式，并逆轉影響皮膚的與年齡相關的疾病。毫不奇怪，2012 年諾貝爾生理學或醫學獎被約翰·格登爵士（Sir John Gurdon）共同授予，因為他開創性地發現青蛙卵母細胞的細胞質中含有可以重新編程成年體細胞核以產生存活青蛙的因子，而山中伸也（Shinya Yamanaka）的發現這些重編程因子的真實身份，為使用基于 iPSC 的技術治療包括皮膚病在內的多種人類疾病打開了大門。