來自臨床健康人類受試者的充分表征的人類誘導多能干細胞 (hiPSC) 資源庫可以作為體外人類發育、疾病建模、基因型-表型關聯研究和藥物反應評估的正常對照的重要資源。

該庫涉及hiPSC 系的性別平衡、種族/民族多樣化庫的生成和廣泛表征，這些資原來自 40 名年齡在 22 至 61 歲之間的臨床健康人類個體。資源庫為每個個體的一個 hiPSC 克隆提供全基因組測序數據、基因組血統確定以及疾病基因和風險分析等。這種廣泛的表征使這個 hiPSC 庫成為許多人類生物學研究的寶貴資源。

近期西奈山醫學院的研究人員發表在Stem Cell Reports的一篇題為

A library of induced pluripotent stem cells from clinically well-characterized, diverse healthy human individuals的文章報道上述內容。

A library of induced pluripotent stem cells from clinically well-characterized, diverse healthy human individuals（來自臨床特征明確的多樣化健康人類個體的誘導多能干細胞資源庫）

自從誘導多能干細胞(iPSC)的開創性發現以來，人類誘導多能干細胞 (hiPSCs) 和從它們分化的細胞已經成為一種強大的體外人類模型系統。表型、疾病病因和機制、基因型-表型相關性和藥物反應。然而，此類研究經常受到用于比較分析的少量 hiPSC 系或各自對照、報告的衍生 hiPSC 的體細胞變異性和分化細胞的異質性的阻礙。近年來，多個科研小組報告了建立各種 hiPSC 系數量范圍廣泛的 hiPSC 資源庫。

這些資源庫主要包括疾病特異性 hiPSC 和對照。對照 hiPSC 系來自沒有研究過特定疾病的受試者，無論是親屬還是非相關個體，他們自稱健康，或沒有病史。然而，在這些研究中，沒有明確進行臨床健康評估，也沒有報告健康狀況的官方文件。盡管如此，此類文庫已被用于研究與復雜基因組特征和表型相關的遺傳變異如何驅動 hiPSC 及其分化細胞的分子和生理變異。

更大規模的比較和有效的疾病建模、藥物發現和評估以及基因型-表型關聯研究受到來自不同種族和民族背景和年齡的臨床篩選的健康個體的 hiPSC 系的有限可用性和包含的影響。

在這里，作為 NIH-基于綜合網絡的細胞特征 (LINCS) 計劃的共同基金項目的一部分，報告了從 40 個不同種族/民族背景的選定個人中創建的 hiPSC 庫，以及通過嚴格的臨床健康評估的年齡。

該庫提供了 hiPSC 來源的每個參與者的臨床特征、細胞遺傳學報告、短串聯重復 (STR) 驗證和所有 40 個 hiPSC 系的多能性分析，以及全基因組測序數據、基因組祖先確定和孟德爾疾病基因和風險評估。

幾項研究表明供體細胞來源、已建立的 hiPSC 的細胞異質性以及性別對細胞分化和生理行為的影響。分化的 hiPSC 缺乏細胞同質性可能會影響測量的生理參數的變異性。然而，尚不清楚從同一健康受試者的多個 hiPSC 克隆分化而來的細胞是否會在生理上表現相同。因此，該庫研究了從來自同一個體的獨立 hiPSC 克隆和來自不同個體的 hiPSC 克隆分化出來的心室和心房心肌細胞 (CMs) 的特征。

總之，我們來自 40 名臨床特征良好的健康人類個體的多樣化 hiPSC 庫為科學界的各種生物醫學和藥理學研究提供了寶貴的資源。

hiPSC資源庫的建立

潛在的健康志愿者是通過機構審查委員會 (IRB) 批準的廣告招募的，并經過預篩選以可能納入研究。96 名滿足初始預篩選同意的男性和女性，并通過登記問卷記錄了他們的性別、年齡和種族/民族。85 人接受了篩選研究醫師的正式和徹底評估。

正式篩查涉及完整的病史；測量體重、身高、腰圍和臀圍、心率、血壓、呼吸頻率和氧飽和度；體檢；和心電圖 (ECG)。抽取血液用于分析臨床相關參數。對女性參與者進行了妊娠試驗。所有抽血和妊娠試驗都被送到經過認證的臨床實驗室進行分析。

（圖 1A）

超過 20 條排除標準包括心電圖異常、任何心血管疾病家族史（不包括年齡小于 50 歲的一級或二級親屬的高血壓）、任何一級或二級親屬的非缺血性心肌病家族史任何年齡、既往器官移植史、HIV 陽性狀態、肌病史、肥胖、腎功能損害、自身免疫性疾病、包括腦鈉肽在內的血液檢測結果異常、體重指數≥30 kg/m2、終生吸煙 >2 包-年，或體檢異常。將數據輸入臨床報告表，然后由兩名資深研究醫師（J.C.K. 和 D.T.）和篩選研究醫師達成共識，對研究資格進行最終評估。

如果資格獲得批準，受試者隨后接受皮膚活檢并正式成為納入研究的受試者之一。在接受篩選的 85 名受試者中，42 名 (48.3%) 被認為符合最終納入條件。總結了篩選對象被排除在進一步參與之外的原因。在 42 名符合條件的個體中，計劃對 40 名進行皮膚活檢。

hiPSC資源庫的重要價值

誘導多能干細胞 (iPSC) 的引入開辟了個性化細胞療法的潛力，并為再生醫學、疾病建模、基于 iPSC 的藥物發現和毒性評估帶來了新機遇。

自 2006 年 Shinya Yamanaka 及其同事 產生誘導多能干細胞 (iPSC) 以來，人們對利用這些非凡細胞的全部潛力越來越感興趣。在培養中，iPSC 能夠自我更新并從所有三個胚層（外胚層、中胚層和內胚層）分化為任何細胞類型，重要的是，iPSC 的使用避免了與胚胎干細胞相關的倫理問題。此外，iPSC 技術的發展允許幾乎無限量的健康或疾病特異性人類多能干細胞。在使用原代的、患者來源的受疾病影響的細胞類型時，獲得此類細胞是一個主要障礙，這些細胞類型代表了疾病建模的“金標準”。由于這些特性，iPSC 在生物醫學研究和開發中具有廣闊的應用前景。

iPSCs在培養中的自我更新特性允許使用來自供體的健康和患病細胞系進行廣泛的研究。已經產生了多個患病的 iPSC 系，允許研究目前難以在動物模型中獲得的人類疾病表型，使 iPSC 成為用于藥物篩選和毒性研究、藥物開發、人類疾病建模、個性化醫療和細胞的有吸引力的選擇。

據估計，分別有 27%、14% 和 7% 的藥物由于對心臟、肝臟和中樞/外周神經系統的不良影響而在臨床試驗中失敗。這部分是由于使用動物模型進行藥物篩選，而這些模型無法很好地復制人體系統 。

使用人類 iPSC 進行藥物篩選可避免在將其用于臨床試驗之前的跨物種差異。這不僅大大減少了藥物篩選研究中使用的動物數量，還提高了臨床試驗的成功率。因此，來自健康和患病患者的 iPSC 作為藥物篩選和毒性研究的首選細胞越來越受到關注。

最近，有研究表明，肌萎縮側索硬化患者 iPSC 衍生的運動神經元表現出過度興奮并降低培養中的存活率。研究人員表明，這可以通過已經獲得 FDA 批準的鉀通道激動劑來糾正，允許該藥物直接進入治療肌萎縮側索硬化癥的 II 期臨床試驗，而無需進行動物研究 。許多其他藥物篩選研究可用于帕金森病、色素性視網膜炎和肺動脈高壓等疾病。

近年來，研究人員將 iPSC 從實驗室帶到了臨床。iPSC 在再生醫學中的使用為該技術的臨床轉化提供了一個令人興奮的機會，即生成患者特異性 iPSC 用于自體移植以修復或替換受損組織。

為了促進日本基于 iPSC 的研究和臨床治療，CiRA 被選為主要中心，開展“再生醫學 iPSC 股票開發項目”。慶應義塾大學、CiRA、RIKEN 和大阪大學充當臨床應用研究中心，旨在促進基于 iPSC 的細胞治療 。

2014年，RIKEN通過移植iPSC來源的視網膜色素上皮細胞進行了iPSC移植治療黃斑變性的首次臨床試驗。結果，沒有觀察到進一步的黃斑變性，患者報告視力有所改善。此外，京都大學/CiRA 的 Takahashi 教授及其同事成功地將 iPSC 衍生的多巴胺能神經元植入帕金森病患者的大腦。這是首個使用 iPSC 治療帕金森病的臨床試驗。Takahaski 報告說，患者恢復良好，如果沒有出現并發癥，他們計劃再治療 6 名患者 。此外，大阪大學的 Sawa 博士和他的團隊獲得了將 iPSC 衍生的心臟細胞片植入三名心力衰竭患者的批準。最近，日本政府衛生部已批準慶應義塾大學醫學院的岡野博士及其同事將 iPSC 衍生的神經細胞注射到四名脊髓損傷患者體內。盡管這些研究仍處于起步階段，但使用 iPSC 的再生醫學和細胞替代療法可能很快就會得到更廣泛的應用。

全球當前的 iPSC 資源庫比較

歐洲誘導多能干細胞銀行 (EBiSC)

EBiSC 于 2014 年與歐洲的多個公共和私人組織合作啟動了其熱啟動項目。Babraham Research Campus 位于英國劍橋，是負責細胞擴增、QC 和表征的主要設施。同樣位于英國的英國公共衛生部的歐洲認證細胞培養物收藏中心 (ECACC) 是向全球用戶提供細胞儲存和分發的主要銀行，而位于德國薩爾布呂肯的 Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik (IBMT) 是一面鏡子ECACC 的存儲庫 。

憑借多年的經驗，EBiSC 以其嚴格的標準化管道而聞名，并為未來 iPSC 銀行的舉措奠定了良好的基礎。在收到捐贈者樣本并附上捐贈者同意書后，將進行病原體/基因檢測。一旦通過，工作流程將繼續進行 iPSC 生成、存放和分發。為了確保所有中央或輔助設施在處理細胞時執行相同的程序，已經建立了文本和視頻格式的標準協議。還舉辦常規培訓課程，以確保機構間的一致性。

EBiSC 的工作流程

iPSC 生成完成后，將進行一系列表征分析以研究支原體和細菌的不育性、使用流動分析和/或肉眼觀察的細胞表型、染色體穩定性（通過 G 顯帶進行核型）、遺傳同一性（STR 分析）、和多能潛能（三胚層分化）。特別值得注意的是，EBiSC 計劃引入新的表征技術，例如自動成像以代替肉眼觀察非整倍體，以及使用 KaryoLite BoBs 代替傳統的 G 帶，因為它易于解釋 KaryoLite BoBs 結果并且是一種快速方法檢測非整倍體。他們還計劃使用 TaqMan 陣列板來評估多能性，目的是提高表征效率。

標準化程序的銀行細胞可以保證 iPSC 更一致的高質量和解凍后存活率。EBiSC 繪制了細胞庫 [50] 的詳細過程，類似于上面提到的表征方法。其他銀行流程包括在不含抗生素的培養基中培養細胞 3 次傳代和隨后的檢測，以驗證細胞不含任何重編程載體。

每個細胞系平均生成 50 個小瓶。大約 90% 的小瓶存放在 ECACC，10% 存放在 Roslin Cell Sciences 和 IBMT 作為備份。為了跟蹤當前的分配狀態，實施了 Item TRACKER 軟件來定位單個小瓶并增強小瓶的可追溯性。為了改善機構間的溝通和管理，EBiSC 開發了信息管理系統 (IMS) 來記錄細胞系信息和狀態。用戶也可以使用IMS在線目錄，請求每個細胞系的數據包，并通過電子商務工具訂購，從ECACC獲取細胞。IMS 設計優雅，還可用作來自各種來源的用戶生成數據的集成平臺。

跨機構轉移 iPSC 小瓶需要清晰的注釋和完整標記的系統。EBiSC 為標記和識別細胞制定了自己的規則，提供諸如保藏者來源、iPSC 系、供體、克隆和亞克隆編號等信息。標簽還包括批次/目錄號和二維二維碼。每個代碼都分配給一個特定的細胞 ID，并與現有的自動冷凍設備兼容。

管道自動化是所有 iPSC 銀行的未來目標。結合人工智能的機械臂，可以及時精確監測細胞形態和融合度，并通過完全相同的內置程序對細胞進行操作。這可以大大提高實驗批次之間的可重復性并減少勞動密集型活動。EBiSC 通過在 IBMT 的細胞庫中建立自動冷凍保存系統來引領自動化基礎設施。其他系統正在開發中，包括 Babraham 研究園區的系統，旨在實現細胞培養和擴增的自動化。

臺灣人類疾病 iPSC 聯盟

臺灣科技部于2015年成立，由5個實驗室組成臺灣人類疾病iPSC聯盟，其中4個iPSC核心位于中央研究院生物醫學研究所（IBMS）、臺灣大學醫院、臺北退伍軍人綜合醫院和國家衛生研究院（2015-2017）。這些核心是負責 iPSC 生成和分化為不同細胞類型（如心肌細胞和視網膜色素上皮細胞）的主要設施，而食品工業研究與開發研究所 (FIRDI) 負責細胞擴增、QC、表征和細胞庫。IBMS自2015年以來一直是該聯盟的領導者和主要管理機構。2019年6月，FIRDI將iPSC表征的職責轉移到IBMS，因此FIRDI現在只負責細胞銀行。

臺灣人類疾病 iPSC 聯盟的工作流程

簽署知情同意書后，從捐贈者身上抽取樣本；然后將它們冷凍保存在合作醫院中。所有捐贈者樣本都使用脫鏈編號進行編碼；但是，提供了其他捐助者信息，例如年齡、性別和特定的基因突變。除此信息外，不包括所有其他個人信息。收到后，對供體樣本進行測試以確認它們不含支原體，此時，在 iPSC 核心使用仙臺病毒生成 iPSC。此外，另外 10 mL 的血液樣本被送到 FIRDI 的一個集中表征核心，在那里進行染色體完整性測試。每個捐贈者的樣本有大約 6 到 10 個額外的小瓶，在液氮中冷凍保存，每個小瓶包含 2 × 106 個細胞作為 iPSC 核心設施的備份。為確認不同 iPSC 核心一致遵循標準化操作協議，在核心設施和核心間設施內舉辦例行培訓課程，每個 iPSC 核心的所有一線工作人員每隔一個月舉行一次實驗室會議。

生成后，iPSC 將保持 8 代，此時收集 RNA 并使用 RT-PCR 測試仙臺病毒的存在。對于每個 iPSC 系，選擇三個仙臺無病毒克隆，從依賴飼養層的培養系統（滅活的小鼠胚胎成纖維細胞）轉移到無飼養層的培養系統。每個 iPSC 克隆大約有 10 瓶被冷凍并儲存在 iPSC Core 的工作細胞庫中。然后將無病毒 iPSC 運送到 FIRDI 進行 iPSC 表征，在那里測試 iPSC 系的凍融活力。

每個克隆都使用標準化程序在生物資源收集和研究中心 (BCRC) 的主細胞庫中進行擴增和冷凍保存。一小瓶 iPSC 被解凍、膨脹，然后進一步冷凍保存到 10 個小瓶的工作細胞庫中。隨后，對從工作細胞庫解凍的 iPSC 進行一系列表征分析。iPSC 表征分析用于 QA，其中包括多能潛能測試（胚胎體形成和畸胎瘤形成）和 iPSC 鑒定（RT-PCR、免疫熒光和流式細胞術）。質量控制檢測包括無菌檢測（檢測支原體、細菌和真菌的存在）、遺傳同一性（STR-PCR 分析）和染色體完整性（通過 G 顯帶進行核型分析）。

此外，進行全基因組單核苷酸多態性 (SNP) 陣列 (Affymetrix Genome-Wide SNP Array 6.0) 以識別在這些 iPSC 中由重編程過程引起的遺傳變異（例如拷貝數變異 (CNV)、SNP 或丟失）雜合性）。完成 QA/QC 檢測后，將為每個細胞系生成一份分析證書。為確保在各研究所之間易于分發，使用條形碼注釋系統來標記所有細胞系。有關生成的 iPSC 的信息以及完整的分析證書，可在 BCRC 的網站上獲得，供臺灣研究人員使用。