通過“時光機器”連接干細胞命運和基因表達

干細胞和前體細胞的分化路徑在單細胞層面存在差異，單個干細胞在分化為不同成熟細胞的過程有著不同的偏好。實驗證明這種命運偏好并不是完全隨機或只受胞外信號的影響，也同細胞內的狀態有關【1】。近年來發展迅速的單細胞測序技術極大的擴展了我們對于干細胞轉錄組異質性的了解。由于單細胞測序具有破壞性，以及干細胞的基因表達和隨后的分化發生在不同的時間。除非時光倒流，對一個干細胞進行測序之后，它的分化路徑不得而知。樹突狀細胞（dendritic cells，DC）聯系體內先天性免疫和適應性免疫，主要包括1型/2型常規樹突細胞 (type 1/2 conventional DC，cDC1，cDC2)，和漿細胞樣樹突細胞（plasmacytoid DC, pDC）【2】。不同類型的DC如何由造血干細胞（hematopoietic stem cells, HSC）分化及調控是尚未被完全解答。造血干細胞在轉錄組層面的異質性，是否和不同類型DC的命運偏好有關？

為了解決這一問題，2021年4月15日，澳大利亞的Shalin Naik團隊在Immunity發表了Clonal multi-omics reveals Bcor as a negative regulator of emergency dendritic cell development?，通過分離分化早期的姐妹細胞并分別進行測序和功能檢驗，將細胞命運和干細胞的基因表達這一發生在不同時間的現象關聯到了一起。研究使用從造血干細胞到樹突狀細胞的體外分化系統作為例子，關聯了造血干細胞轉錄組異質性和不同的DC命運偏好。并進一步通過CRISPR篩選并驗證了Bcor作為cDC2和pDC的負調控基因，同時揭示了Bcor在抑制cDC2和pDC分化上扮演的不同作用。

作者首先探究了FLT3L介導的造血干細胞分化早期（day 2.5-4.5）的姐妹細胞，最終分化為三種不同DC的能力，并且發現了來自同一造血干細胞的姐妹細胞，其分化路徑的偏好高度一致。例如某個來自同一個造血干細胞的姐妹細胞都具有強烈的cDC2偏好，而較少分化為cDC1和pDC。姐妹細胞命運偏好的相似性，使得它們可以被分離成多組，一部分細胞進行轉錄組測序而另一部分細胞繼續進行體外分化（SIS-seq）。在對多個造血干細胞的姐妹細胞進行獨立的分離和測序后，作者使用了帶有正則化的廣義線性模型來尋找干細胞基因表達和命運偏好的關聯，并且篩選出超過400個基因。其中包括多個已知的調控DC分化的基因，例如Id2，Batf3，Irf4等，從側面證明了這一方法在發現調控干細胞命運的基因上的作用。不僅如此，篩選出的列表中還包含了大量未經報道的基因。例如高表達Bcor的干細胞，其姐妹細胞會更多的分化為cDC1而不是cDC2和pDC。

為了進一步驗證這些基因的調控功能，作者使用CRISPR對這些基因進行高通量篩選，并且確認了多個調控DC分化的新基因。其中，敲除了Bcor的造血干細胞會大量分化為cDC2和pDC，但是cDC1的數量并沒有顯著的增加，和之前的實驗一致。與此同時，作者還發現了敲除Bcor會增加疑似DC的前體細胞（pre-DC）。為了更好的在單細胞層面刻畫Bcor敲除對轉錄組的影響，作者同時對Bcor敲除后DC分化路徑上的細胞以及空白對照進行了單細胞測序。在數據整合之后，敲除了Bcor的成熟細胞cDC1，cDC2和pDC的關鍵marker表達類似。同時實驗表明敲除Bcor之后分化出的成熟DC細胞依然可以行使其功能，說明Bcor可能并不影響成熟DC。雖然成熟細胞的基因表達類似，Bcor敲除后的干細胞分化出大量的前體細胞。通過和已知數據庫Immgen的比對，發現這些前體細胞的轉錄組和造血干細胞的不同分化時期類似（MPP，CDP，CLP）。結合多個實驗的結果，Bcor敲除后的干細胞會生成大量的DC前體細胞，并且這些細胞具有cDC2和pDC的分化偏好。在體內實驗中，作者發現，Bcor在穩態下并不影響DC分化的命運選擇，只有在FLT3L刺激的體內環境下才會明顯增加cDC2和pDC的數量，說明Bcor對cDC2和pDC的調控是依賴于FLT3L的。

盡管Bcor敲除對cDC2和pDC的正調控作用已經得到了確認，但是在單個干細胞克隆層面，這種調控可能有多種表現形式。例如，本來缺乏cDC2和pDC的分化能力，命運偏向cDC1的干細胞在敲除Bcor后獲得了cDC2和pDC的分化能力（fate gain），亦或是本來就可以生成三種DC的干細胞，在敲除后，cDC2和pDC的分化路徑得到了加強，細胞數量擴增（clonal expansion）。使用類似的思路，作者在造血干細胞中加入DNA條形碼進行譜系示蹤，并使用來自同一造血干細胞的姐妹細胞分開進行實驗，對一部分細胞敲除Bcor，另一部分細胞作為空白對照，來探究Bcor對干細胞自身的細胞命運決定有什么影響（SIS-skew）。實驗結果顯示，pDC的細胞數量增加，主要來自fate gain，也就是本來缺乏pDC分化能力的細胞可以分化為pDC。而cDC2的細胞數量增加主要來自于clonal expansion，即原來就可以分化cDC2的干細胞，其分化繁殖能力得到了加強。該試驗進一步揭示了Bcor在調控不同DC分化上的功能差異。

總的來說，文章提供了一種研究干細胞分化的一般思路，來關聯干細胞狀態和其分化路徑。該方法不僅局限于轉錄組，也可以通過將姐妹細胞分離為多組，來對其進行克隆層面的多組學研究，或是在多個時間點進行分離，研究動態的分化軌跡【3】。也可以使用可表達的DNA條形碼，同時標記多個造血干細胞并分離姐妹細胞來增加通量【4】。田魯亦，Sara Tomei,?Jaring Schreuder為本文的共同第一作者。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.03.012

參考文獻：

1. Naik, S., Perié, L., Swart, E. et al. Diverse and heritable lineage imprinting of early haematopoietic progenitors.Nature?496, 229–232 (2013). https://doi.org/10.1038/nature12013

2. Shortman, K., Liu, YJ. Mouse and human dendritic cell subtypes.?Nat Rev Immunol?2, 151–161 (2002). https://doi.org/10.1038/nri746

3. Lin, D.S., Tian, L., Tomei, S. et al. Single-cell analyses reveal the clonal and molecular aetiology of Flt3L-induced emergency dendritic cell development.?Nat Cell Biol?23, 219–231 (2021). https://doi.org/10.1038/s41556-021-00636-7

4. Weinreb C, Rodriguez-Fraticelli A, Camargo FD, Klein AM. Lineage tracing on transcriptional landscapes links state to fate during differentiation.?Science.2020;367(6479):eaaw3381. doi:10.1126/science.aaw3381