間充質(zhì)干細(xì)胞，中風(fēng)治療的候選細(xì)胞藥物

編輯｜南風(fēng)

前言/ “目前，由于治療窗狹窄、并發(fā)癥嚴(yán)重，大多數(shù)患者不能選擇靜脈溶栓或血管內(nèi)機(jī)械取栓。干細(xì)胞移植是一種新興的治療方法，并已在各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中進(jìn)行了研究。動物和臨床研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）移植可以緩解神經(jīng)功能缺損，為缺血性卒中治療帶來希望。

本文綜述了間充質(zhì)干細(xì)胞治療的生物學(xué)特性、安全性、可行性和有效性、間充質(zhì)干細(xì)胞的潛在治療靶點以及良好生產(chǎn)規(guī)范級間充質(zhì)干細(xì)胞的生產(chǎn)工藝。”

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目前，溶栓和機(jī)械取栓已經(jīng)徹底改變了缺血性卒中的治療。然而，仍存在時間窗窄、出血風(fēng)險、可用性和治療成功率等問題?_[1,2]。因此，尋找治療時間窗更寬、出血風(fēng)險更低的新替代方案對改善神經(jīng)功能和降低死亡率非常重要。基于干細(xì)胞的療法正在成為中風(fēng)患者功能恢復(fù)的理想候選者 _[3,4]。

各種類型的干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），以及血管和內(nèi)皮祖細(xì)胞，已被用于治療缺血性腦卒中_[5]。越來越多的證據(jù)表明，間充質(zhì)干細(xì)胞通可影響缺血性卒中的病理過程，包括在急性、亞急性和慢性期減少炎癥、調(diào)節(jié)免疫功能、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)血管、白質(zhì)和突觸重塑 _[4,5]。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞可能是理想的“種子細(xì)胞”，特別適用于神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性疾病的細(xì)胞移植治療。

在此，我們回顧了間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中的潛在機(jī)制和治療靶點，包括旁分泌效應(yīng)分子、調(diào)節(jié)免疫功能和神經(jīng)元、白質(zhì)和突觸的重塑，以及GMPs級間充質(zhì)干細(xì)胞的產(chǎn)生過程，期待有效的提高關(guān)于MSCs治療缺血性卒中療效的一般結(jié)論，特別是在臨床試驗中，并為缺血性卒中提供新的治療方向。

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間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）概述

MSCs于1970年由 Friedenstein及其同事首先發(fā)現(xiàn)，并于1991年被Caplan命名為“間充質(zhì)干細(xì)胞”。隨后，MSCs 在文獻(xiàn)中有許多替代名稱，包括間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞、多能基質(zhì)細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、中胚層干細(xì)胞細(xì)胞，甚至藥用信號細(xì)胞 _[7]。間充質(zhì)干細(xì)胞可以從多種組織中獲取，并具有自我更新和多向分化的潛力，可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和支持造血的基質(zhì)細(xì)胞 _{[7, 8]}。在生長中的動物和臨床研究表明，體內(nèi)只有少數(shù)移植的MSCs發(fā)生了分化_{[8, 9]}，證實了MSCs主要通過其他途徑發(fā)揮治療作用，而不是分化為組織細(xì)胞_[8]。因此，Caplan認(rèn)為MSCs不是“干細(xì)胞”，而是作為治療劑的藥物信號細(xì)胞，以說明它們適應(yīng)局部微環(huán)境的多功能性和靈活性 _[8]。

目前，間充質(zhì)干細(xì)胞已成為研究最廣泛的干細(xì)胞，廣泛用于治療各種疾病的臨床試驗，包括血液疾病、肝腎肺終末期疾病、移植物抗宿主病、自身免疫性疾病、各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，甚至感染COVID-19 的患者 _[10,11]。

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MSC移植治療缺血性卒中的安全性、可行性和有效性

中風(fēng)動物模型研究

在大鼠缺血性卒中急性期，間充質(zhì)干細(xì)胞治療通過保護(hù)線粒體功能、抑制神經(jīng)元凋亡和焦亡、減少梗死體積的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，以增加神經(jīng)元的重塑和功能恢復(fù)_[12]。在大鼠缺血性卒中亞急性期，GMP級人臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞 (hUCMSCs) 治療有效改善了行為缺陷，減少了梗死體積和膠質(zhì)瘢痕形成，促進(jìn)了缺血半影區(qū)的血管生成 _[13]。此外，在亞急性期，hMSCs 還通過抑制促炎細(xì)胞因子和M2到M1巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，來減少梗死周圍區(qū)域的血腦屏障 (BBB) 受損和細(xì)胞凋亡 _[14]。在慢性中風(fēng)大鼠模型中，移植hUCMSCs可維持BBB完整性，減輕行為缺陷，并促進(jìn)神經(jīng)和血管再生_[15]。這些研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠急性、亞急性和慢性缺血性卒中是安全、可行和有效的。

中風(fēng)臨床試驗研究

2005年，Bang等人前瞻性隨機(jī)檢查了30例大腦中動脈區(qū)域內(nèi)腦梗死和嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損患者的，培養(yǎng)擴(kuò)增自體MSCs移植的短期可行性、有效性和安全性。MSCs組患者在卒中7天內(nèi)靜脈輸注1×10⁸個自體MSCs，并隨訪長達(dá)1年。結(jié)果表明，MSCs可以促進(jìn)功能恢復(fù)，并且沒有報告任何與移植相關(guān)的不良事件 _[16]。2010 年，他們還對85名嚴(yán)重大腦中動脈供血區(qū)梗死患者進(jìn)行 iv MSCs 移植的長期安全性和有效性進(jìn)行了評估。MSCs組患者接受iv自體提取培養(yǎng)的MSCs并隨訪長達(dá)5年。結(jié)果還表明，MSCs是安全的，可以促進(jìn)功能恢復(fù)，具體取決于患者的發(fā)病特征，并且與血清基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1水平和側(cè)腦室室下區(qū)受累程度有關(guān)_[17]。

隨后，Jaillard等人在兩項II期試驗中，還證實了MSCs在亞急性卒中治療上的安全性和可行性 _[18,19]。同樣，治療慢性中風(fēng)的研究也證明了MSCs的安全性、可行性和治療效果 _[20]。這些臨床試驗還表明，MSCs治療對急性、亞急性和慢性缺血性卒中患者的治療是安全、可行和有效的。

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MSC移植治療缺血性腦卒中的潛在機(jī)制和治療靶點

動物模型和臨床試驗研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可以有效治療缺血性中風(fēng)。間充質(zhì)干細(xì)胞如何發(fā)揮治療作用？間充質(zhì)干細(xì)胞的治療靶點是什么？如圖 1所示，列出了MSCs 移植治療缺血性卒中的潛在治療靶點。

旁分泌效應(yīng)

MSCs可以通過旁分泌產(chǎn)生和分泌大量的趨化因子、細(xì)胞因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子和細(xì)胞外囊泡（EVs），通常稱為MSCs分泌組。這些分子和EV將通過多種方式為MSCs移植治療缺血性中風(fēng)的治療靶點提供有價值的見解，例如抗炎、抗凋亡、抑制纖維化、促進(jìn)血管生成和神經(jīng)發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)等功能_[21] 。我們將這些生物效應(yīng)分子的作用，進(jìn)一步總結(jié)在表1中。

體內(nèi)和體外研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過與適應(yīng)性和先天免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞相互作用來修復(fù)受損的腦組織來調(diào)節(jié)免疫。間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能是通過細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸和可溶性因子的釋放來發(fā)揮的。圖2顯示了MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用。

調(diào)節(jié)腦細(xì)胞的功能和命運(yùn)

間充質(zhì)干細(xì)胞還可以通過調(diào)節(jié)腦細(xì)胞的命運(yùn)和功能來改善腦功能_[3]。（圖 3）描述了MSCs在中風(fēng)后調(diào)節(jié)腦細(xì)胞命運(yùn)和功能中的作用。

提高細(xì)胞存活率

自噬機(jī)制在腦缺血早期具有神經(jīng)保護(hù)作用，在腦缺血持續(xù)時間較長時變?yōu)樯窠?jīng)毒性作用。間充質(zhì)干細(xì)胞移植可通過增加早期（缺血后24小時內(nèi)）自噬來減少腦缺血損傷，并通過在后期（缺血后48-72小時）抑制自噬來提高神經(jīng)元存活率。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種形式。MSCs移植還可以通過多種方式抑制細(xì)胞凋亡。例如，間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過在體內(nèi)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶和STAT3和Akt的磷酸化來抑制細(xì)胞凋亡_[64]，抑制谷氨酸興奮性毒性，降低Ca 2+和表面GluR1的水平 _[65]，或激活抗凋亡因子 Bcl-2并抑制腦缺血后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和促凋亡分子Bax_[66]。

間充質(zhì)干細(xì)胞還可以通過線粒體拯救受損細(xì)胞。據(jù)曾等人報道，在體外暴露于過氧化氫后 24小時，MSCs線粒體可以轉(zhuǎn)移到神經(jīng)元，這取決于細(xì)胞間的接觸。在體內(nèi)腦缺血后，受損腦微血管的宿主細(xì)胞接受移植的MSCs線粒體，從而顯著改善受損微血管的線粒體活性，增強(qiáng)血管生成，減少梗死體積，促進(jìn)功能恢復(fù) _[68]。這些研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過將自己的線粒體轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞中來拯救受損細(xì)胞。

促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)/少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖、遷移和分化

腦缺血可誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生和少突神經(jīng)發(fā)生，不足以促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和少突神經(jīng)發(fā)生，改善神經(jīng)功能恢復(fù)。據(jù)報道，MSCs移植通過增加趨化因子和聚唾液酸化酶的表達(dá)，顯著增加了腦缺血條件下內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞 (NPCs) 的增殖、遷移和分化_[69]。

細(xì)胞融合

細(xì)胞融合是骨髓衍生細(xì)胞與轉(zhuǎn)移其遺傳物質(zhì)并混合其細(xì)胞質(zhì)的局部前體或成熟細(xì)胞的融合。研究表明，MSCs可以與多種不同的細(xì)胞融合，例如神經(jīng)元、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞，甚至癌細(xì)胞。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過細(xì)胞融合修復(fù)受損的腦組織。坎普等人報道，在成熟的大腦中，骨髓衍生細(xì)胞與體內(nèi)神經(jīng)元的融合導(dǎo)致形成自發(fā)放電的神經(jīng)元。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞還具有在間隙連接中介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的潛力，從而啟動細(xì)胞融合。間充質(zhì)干細(xì)胞通過與內(nèi)皮細(xì)胞的間隙連接對BBB的免疫調(diào)節(jié)和維持功能具有重要作用 _[75]。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過與缺血性卒中后的神經(jīng)元和周細(xì)胞融合來促進(jìn)腦組織的修復(fù)。

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能

膠質(zhì)細(xì)胞是腦組織中除神經(jīng)元外最重要的細(xì)胞亞群。膠質(zhì)細(xì)胞包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。A2星形膠質(zhì)細(xì)胞通過上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用。A1星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后迅速形成，并對髓鞘、突觸和神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。間充質(zhì)干細(xì)胞移植通過阻止星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)A2星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、抑制膠質(zhì)瘢痕形成、通過調(diào)節(jié)缺血性卒中后NF-κB信號通路抑制軸突再生來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用_[77]。上述研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞功能促進(jìn)缺血性腦組織的修復(fù)。

由Azizi等人在1998年發(fā)表了第一篇關(guān)于人間充質(zhì)干細(xì)胞移植到大鼠腦中的報告可見，越來越多的人對間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)行了研究。間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療正逐漸從實驗室走向臨床治療。盡管有許多注冊的臨床試驗 ( http://www.clinicaltrial.gov/ )，但對于MSCs的制造并沒有達(dá)成共識。從缺血性卒中患者的臨床試驗中獲得的結(jié)果，已在薈萃分析研究中進(jìn)行了分析 _[79]。

臨床初步證實了MSCs治療是安全的，并且可以改善主要臨床終點。然而，間充質(zhì)干細(xì)胞作為先進(jìn)的細(xì)胞治療藥物，需要符合GMP的生產(chǎn)和質(zhì)量控制（包括設(shè)施管理、員工培訓(xùn)、制造程序和質(zhì)量控制）。由于在MSCs生產(chǎn)和質(zhì)量測試中缺乏經(jīng)過驗證、安全和可重復(fù)的程序，因此不同臨床試驗的結(jié)果通常是無法參考的。因此，很難就MSCs治療對缺血性卒中的影響得出有效和普遍的結(jié)論。所以我們將重點關(guān)注GMP級MSCs生產(chǎn)中治療靶點相關(guān)的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制，為MSCs在缺血性腦卒中治療中的臨床轉(zhuǎn)化提供更多可能。

供體、細(xì)胞來源和培養(yǎng)過程

在臨床級MSCs的大規(guī)模生產(chǎn)過程中，對供體資格（主要是年齡和病毒檢測）進(jìn)行篩選和檢測非常重要。供體應(yīng)避免MSCs可能涉及的其他異常風(fēng)險。供體的年齡也是一個重要的標(biāo)準(zhǔn)，因為MSCs的增殖和多能性與供體的年齡直接相關(guān)_[80]，并且來自兒童的MSCs具有更高水平的分化能力及活性?(CFU-Fs) _[81]。

細(xì)胞分離技術(shù)是干細(xì)胞用于再生醫(yī)學(xué)、體外擴(kuò)增和潛在臨床應(yīng)用之前的非常重要的步驟。是獲得足夠材料和提高M(jìn)SCs治療效率的主要因素?_[4,82]。目前，最常報道的MSCs來源是骨髓、脂肪組織以及新生兒和胎兒組織衍生的MSCs。與體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，ADMSCs 似乎表現(xiàn)出更高的增殖潛力并更快地產(chǎn)生臨床有效的細(xì)胞劑量 _[84]。最近的研究表明，來自臍帶的符合GMP的臨床級MSCs的易獲取和具有更高的增殖潛力，是GMP生產(chǎn)的推薦來源_[85]。

體外擴(kuò)增MSCs的對照

冷凍保存可維持MSCs的細(xì)胞功能（例如，免疫調(diào)節(jié)和分化能力）和存活率，然而，在將 MSCs移植到動物或患者體內(nèi)之前，凍融細(xì)胞的瞬時升溫會損害MSCs在體外的擴(kuò)增、活力和效力，并破壞部分細(xì)胞膜，這可能會改變IFN-γ受體的信號傳導(dǎo)并下調(diào)吲哚胺的表達(dá)2,3-雙加氧酶 (IDO) _[90]，損害MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能，增強(qiáng)免疫細(xì)胞和補(bǔ)體系統(tǒng)裂解的脆弱性，并降低靜脈給藥后的體內(nèi)持久性_[91]。

目前，已經(jīng)報道了多種對MSCs的復(fù)蘇方法來提高其治療效果，包括缺氧、3D培養(yǎng)、藥物、細(xì)胞因子和生長因子。例如，持續(xù)的低氧張力通過激活糖酵解改善了MSCs的生長和遺傳穩(wěn)定性 _[92]。3D載體培養(yǎng)可以促進(jìn)MSCs擴(kuò)增并增加抗炎特性 _[40,93]。寡霉素或促炎細(xì)胞因子通過激活A(yù)MPK信號傳導(dǎo)增加MSCs的免疫抑制特性 [94]。GMP級hUCMSCs的代謝重編程增加了它們在急性移植物抗宿主病中的抑制潛力_[95]。

盡管有許多方法可以提高M(jìn)SCs 培養(yǎng)規(guī)模并將MSCs用于臨床應(yīng)用，但仍有許多機(jī)構(gòu)尚未符合GMP級標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。

MSCs的效力測定

在臨床試驗中，MSCs的效力測定是必不可少的，其中包括MSCs的表面標(biāo)志物、分化潛能、衰老狀態(tài)、分泌組和免疫調(diào)節(jié)功能 _[4]。芬尼等人建立“臨床適應(yīng)癥預(yù)測量表”（CLIP）并報道轉(zhuǎn)錄因子Twist1調(diào)節(jié)MSCs的功能。換言之，Twist1高表達(dá)的MSCs具有生長快、CFU-Fs活性高、內(nèi)在細(xì)胞凋亡水平低和促血管生成表型的特征，而Twist1低表達(dá)的MSCs 具有抗炎和抗炎的特征。免疫調(diào)節(jié)活性 _[96]。欽納杜賴等人通過定量RNA序列和分泌組分析估計了MSCs和外周血單核細(xì)胞之間的體外免疫調(diào)節(jié)能力。結(jié)果表明，MSCs通過大量介導(dǎo)IDO抑制T細(xì)胞增殖，這與CXCL9、CXCL10、VEGF和CCL2的分泌和表達(dá)有關(guān)_[97]。在MSCs-外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)環(huán)境中，循環(huán)分析方法顯示MSCs中STAT1和STAT3的磷酸化與T細(xì)胞抑制相關(guān) _[98]。因此，應(yīng)結(jié)合MSCs異質(zhì)性、分子標(biāo)記和局部微環(huán)境的高度復(fù)雜性，進(jìn)一步探索驗證MSCs身份和質(zhì)量的效力測定。

至此本文闡述了用于缺血性中風(fēng)的GMP級MSC的生產(chǎn)。現(xiàn)有研究的結(jié)果提供了有關(guān)干細(xì)胞治療的安全性和可行性的數(shù)據(jù)。由于患者群體、細(xì)胞來源、給藥時間和給藥方法的差異，需要解決定義和實施相關(guān)安全控制的難點，特別是測試遺傳穩(wěn)定性和嚴(yán)格的效力測定，以標(biāo)準(zhǔn)化MSC治療并避免結(jié)果偏差。

總之，MSCs可以用作中風(fēng)治療的候選細(xì)胞治療藥物，具有改善缺血性患者的神經(jīng)功能、存活率和生活質(zhì)量的潛力。

參考資料：暫不提供