Nature子刊：我國科學家揭示干細胞衍生性外泌體修復缺血性肌肉損傷機制

2021年4月14日訊/生物谷BIOON/—下肢缺血是一種嚴重的臨床癥狀，影響著全世界許多患者，目前尚無有效的治療方法。缺血激活NLRP3炎性體，進而通過釋放炎癥性細胞因子IL-1β和IL-18觸發(fā)組織損傷。然而，NLRP3炎性體激活的分子機制在很大程度上仍然未知。

在一項新的研究中，來自中國蘇州大學、廣州醫(yī)科大學、阜外醫(yī)院、中山大學和吉林大學第二醫(yī)院的研究人員利用RNA測序（RNAseq）比較了缺血的肌肉和正常肌肉的mRNA表達。RNAseq顯示Rb1（retinoblastoma-1）、NLRP3炎性體、IL-1β和IL-18的mRNA水平增加（圖1a，b），這一點在qRT-PCR實驗中得到證實（圖1c）。這些發(fā)現(xiàn)也通過Western blot（圖1d）和ELISA（圖1e）在蛋白水平上得到了驗證。對這些上調的基因進行基因本體分析，揭示了缺血肌肉中與炎癥反應途徑和NLRP3炎性體相關的生物學過程，從而證實炎癥相關信號通路參與缺血誘導的肌肉損傷（圖1f）。為了驗證RNAseq數據，這些作者還進行了蛋白測序。熱圖（heat map）和Spearman相關分析顯示，缺血肌肉中Rb1、NLRP3、IL-1β和IL-18存在良好的蛋白-mRNA相關性。

Rb1蛋白是一種已知的腫瘤抑制蛋白，Rb1的失活會促進骨骼肌細胞的增殖，但是Rb1在缺血性肌肉損傷中的作用仍然未知。為了解決這個問題，這些作者構建出肌肉特異性Rb1基因敲除（Rb1-mKO）小鼠。在缺血性后肢損傷后，Rb1-mKO小鼠的血流恢復比對照組小鼠快。在損傷后28天時，Rb1-mKO小鼠的后肢握力、耐力以及骨骼肌與體重的比值也較高。這些結果表明，Rb1基因的丟失可以促進損傷后的骨骼肌修復。此外，Rb1-mKO小鼠肌肉中NLRP3和Caspase-1的蛋白表達以及IL-1β和IL-18的血漿水平均低于對照組小鼠，這表明Rb1基因的缺失導致NLRP3信號通路受到抑制。為了證實這些發(fā)現(xiàn)，他們通過用脂多糖（LPS）和ATP刺激C2C12成肌細胞（myoblast），建立了炎性體激活的體外模型。敲降Rb1（Rb1-siRNA）增強了細胞增殖，降低了NLRP3和Caspase-1的激活，并降低了IL-1β和IL-18的水平。

圖1.腫瘤抑制蛋白Rb1是骨骼肌中的一種NLRP3炎性體誘導劑。圖片來自Signal Transduction and Targeted Therapy, 2021, doi:10.1038/s41392-021-00520-8。

這些作者利用STRING數據庫鑒定出調控Rb1的上游信號分子，發(fā)現(xiàn)它與CDK6和轉錄因子E2F相互作用。以前的研究已表明miR-29b靶向CDK6，因此他們研究了miR-29b是否調節(jié)CDK6/Rb1。正如Targetscan所示，CDK6 mRNA的3’UTR有miR-29b的多個結合位點，而且雙熒光素酶實驗證實CDK6是miRNA-29b的靶點。此外，miR-29b模擬物抑制了C2C12細胞中CDK6蛋白的表達和Rb1蛋白的磷酸化。

為了確定miR-29b是如何被調控的，這些作者使用環(huán)狀RNA （circRNA）測序來比較缺血肌肉和正常肌肉中circRNA的表達。在缺血肌肉中檢測到幾種促進細胞增殖的circRNA（cPWWP2A、circ_CCDC66和circ_HECTD1）。在這些circRNA中，cPWWP2A的表達最強，但在缺血條件下，它的表達量急劇下降。這些發(fā)現(xiàn)在qRT-PCR實驗中得到證實。

由于干細胞衍生的外泌體可以促進組織修復，這些作者將對照外泌體(NC-Exos)或沉默cPWWP2A表達的外泌體（si-Exos）注入缺血肌肉，以確定cPWWP2A是否參與介導源自人臍帶衍生間充質干細胞（UMSC）的外泌體（UMSC-Exos）在肌肉中的有益作用。NC-Exos處理導致肌肉中cPWWP2A的表達增加，而si-Exos減弱了這種表達。與注射NC-Exos的小鼠相比，si-Exos處理導致血流恢復較慢 (圖1g、h)，運動功能較差，肌肉力量和跑步距離減少，肌肉與體重比降低，NLRP3、Caspase-1表達較高(圖1i)，血漿中IL-1β和IL-18水平增加(圖1j)。這些注射到小鼠體內的外泌體直徑為30～100nm，僅在肌肉中檢測到。與轉染NC-Exos的細胞相比，轉染si-Exos的C2C12細胞中NLRP3和Caspase-1的表達量明顯更高。因此，在si-Exos處理后，IL-1β和IL-18的水平增加了，并且細胞增殖受到抑制。

這些作者基于CircBank分析確定了miR-29b和cPWWP2A之間的相互作用（圖1k）。cPWWP2A和miR-29b之間的聯(lián)系在雙熒光素酶實驗中得到證實，該實驗顯示miR-29b與cPWWP2A存在較強的結合(圖1l)。miR-29b在缺血肌肉中的表達增加了，這與cPWWP2A的表達相反。這些結果表明，cPWWP2A是miR-29b的分子海綿（molecular sponge）。為了驗證cPWWP2A/miR-29b調控NLRP3信號通路，用miR-29b抑制劑處理C2C12細胞，這降低了NLRP3和Caspase-1的表達以及IL-1β和IL-18的釋放，但增強了C2C12細胞增殖，不過這些效應可被si-Exos逆轉（圖1m）。相應地，敲降C2C12細胞中的cPWWP2A導致CDK6 mRNA和蛋白的表達減少。此外，C2C12細胞的分化被cPWWP2A siRNA抑制，但被miR-29b抑制劑激活。這些數據表明，cPWWP2A通過miR-29b/CDK6途徑調節(jié)Rb1。

以前的研究已表明，Rb1的下調導致E2F轉錄因子的釋放，進而激活AMP激酶α2（AMPKα2）的轉錄。

AMPKα2抑制平滑肌細胞中NLRP3的激活。這些作者試圖確定Rb1是否調節(jié)骨骼肌中AMPKα2的表達。他們的數據顯示，Rb1-mKO小鼠中AMPKα2 mRNA和蛋白的表達增加。AMPKα2沉默導致NLRP3和Caspase-1的表達增加，IL-1β和IL-18在細胞上清液中的釋放增加，細胞增殖減少。此外，在肌肉中注射AMPKα2 siRNA可增加肌肉中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA表達，NLRP3和Caspase-1的蛋白表達，以及小鼠血漿中IL-1β和IL-18的水平。這些數據表明，Rb1的下調通過激活AMPKα2來抑制NLRP3的激活。

綜上所述，Rb1蛋白是一種已知的腫瘤抑制蛋白，但是這些作者發(fā)現(xiàn)它在骨骼肌中作為NLRP3炎癥體誘導劑起作用。他們進一步證實，下調Rb1可通過E2F/AMPKα2介導的信號通路阻止NLRP3炎性體的激活。Rb1被CDK6失活，而CDK6是miR29b的下游靶點。在缺血肌肉中，miR29b的水平增加，導致CDK6的表達減少和Rb1的過度激活。因此，他們破解了一種新的機制，即通過cPWWP2A/Rb1/AMPKα2/NLRP3信號通路調節(jié)NLRP3炎性體（圖1n）。重要的是，他們發(fā)現(xiàn)，UMSC-Exos可以補充缺血肌肉中cPWWP2A的丟失。因此，Rb1基因敲除方法可以通過使用釋放cPWWP2A以促進肌肉修復的UMSC-Exos轉化為臨床應用。（生物谷 Bioon.com）

參考資料：

Yanli Wang et al.?Stem cell-derived exosomes repair ischemic muscle injury by inhibiting the tumor suppressor Rb1-mediated NLRP3 inflammasome pathway. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2021, doi:10.1038/s41392-021-00520-8.