行業報告 | 全球臨床試驗中的外泌體及其GMP級生產標準

原文標題xosomes in clinical trial and their production in compliance with good manufacturing practice，作者Yu-Shuan Chen等，該文此前發表在Tzu Chi Medical Journal。

 

外泌體是由細胞分泌的 60-200 nm 的細胞外囊泡，已被用作疾病治療中的活性藥物成分或藥物載體。

 

人類和植物來源的外泌體已在臨床試驗中注冊，但人類來源的外泌體有更完整的報告。由于外泌體充當囊泡并攜帶細胞分泌成分，因此它們已被用作治療疾病的藥物或肽載體。

 

樹突狀細胞 (DC) 和間充質干細胞 (MSC) 是兩種流行的外泌體制備細胞來源。來自 DC 的外泌體可以引發患者的炎癥，尤其是癌癥患者，因為它們含有腫瘤抗原以誘導特定的炎癥反應。

 

可以使用成熟的 MSCs 細胞資源，這些細胞可用作外泌體制備的替代來源。MSC衍生的外泌體的主要應用是炎癥治療。臨床試驗中的外泌體需要符合良好生產規范（GMP）。外泌體 GMP 中普遍存在三個重要問題，即細胞培養過程的上游、純化過程的下游和外泌體的質量控制。本文簡要回顧了外泌體的開發，包括外泌體的產生和臨床試驗應用。

 

細胞外囊泡 (EVs)?與外泌體

 

細胞外囊泡 (EVs) 由細胞分泌并在體液中循環利用，是涵蓋外泌體、微囊泡 (MVs)、微粒、外泌體、腫瘤體和凋亡小體的統稱。上述術語的差異取決于大小。腫瘤體具有轉移致癌物質的能力，表現出非典型的大尺寸（1-10 μm）。

 

MV 的大小范圍為直徑 50 至 1000 nm。外泌體的范圍為 60 至 200 nm。凋亡小體或胞外體的分離是通過~300-500×g（去除細胞）的程序獲得的，然后以~1000×g的離心力去除細胞碎片，最后在更高的g力下進行更長時間的離心（~ 10,000

 

分離外泌體最常用的方法是 100,000–120,000 ×g 的超速離心 (UC) 。除核酸外，EV的成分還包括脂質和蛋白質。此外，細胞外囊泡具有細胞來源的特性。2018 年國際細胞外囊泡學會?(MISEV2018) 提出了細胞外囊泡標準。根據 MISEV2018 對 EV 的一般表征將包含至少三個 EV 的陽性蛋白標記，包括至少一種跨膜/脂質結合蛋白和胞質蛋白，以及至少一種陰性蛋白標記。

 

MISEV2018 中已經提到了蛋白質與顆粒比例的重要性。除了 MISEV2018 的定義外，其他術語可能更適合作為細胞外粒子。外泌體已被用作病理標志物、基因載體和藥物載體。外泌體的大小為 60-200 nm，由于其生物相容性，外泌體具有作為抗癌藥物載體的巨大潛力。為了確保外泌體的生物活性，標準化的外泌體制造工藝，例如符合良好生產規范（GMP）的工藝至關重要。

 

由于外泌體是由細胞分泌的，因此可以使用大規模的細胞培養系統建立生產系統。由于宿主細胞分泌囊泡的粒徑和特征相似，下游純化系統應優選符合藥品或疫苗生產程序和生產環境。

 

外泌體 GMP 的挑戰是質量控制。盡管先前的研究已經定義了外泌體的標志物，但產生外泌體的細胞類型是多種多樣的。大多數研究都集中在外泌體在臨床前或臨床試驗中的產生和應用 。

 

因此，本文簡要回顧了臨床試驗中的外泌體及其符合GMP的生產。討論了GMP的三個主要標準，包括細胞培養系統的上游、純化系統的下游和外泌體的質量控制。文章中提到了參與臨床試驗的人類和植物來源的外泌體 [圖 1]。

 

圖1 臨床試驗中外泌體總結和符合良好生產規范的外泌體生產流程圖。DC：樹突狀細胞，MSC：間充質干細胞，LC-MS：液相色譜-質譜法

 

遵循良好生產規范的外泌體生產

 

外泌體是由細胞質膜內陷形成的直徑為 60-200 nm 的單層小囊泡。外泌體廣泛分布于所有組織、細胞間隙和體液中。幾乎所有的細胞都分泌外泌體。外泌體，類似于郵遞員，可以通過細胞表面受體準確傳遞到特定器官細胞，進行細胞間傳遞。

 

近年來GMP級外泌體的生產方法（見表1）。GMP級外泌體生產方法包括細胞類型、培養環境、培養體系、解離酶和培養基。生產后需進一步提純，一般分為三步工藝。外泌體GMP的第三個問題是鑒定方法的建立，包括物理結構和生物活性功能特征。

 

表格1 符合良好生產規范的外泌體生產方法總結

MDDCs：單核細胞衍生的樹突狀細胞，BM-MSCs：骨髓間充質干細胞，hCPCs：人心臟祖細胞，ADSC：脂肪衍生干細胞，PL：血小板裂解物，HPL：人血小板裂解物，FBS：胎牛血清, EV: 細胞外囊泡, EDTA: 乙二胺四乙酸, UC: 超速離心, TFF: 切向流過濾, SWC: 尺寸排阻色譜, UF: 超濾, NTA: 納米粒子跟蹤分析儀, TEM: 透射電子顯微鏡, LC-MS: 液相色譜-質譜，SEC：尺寸排阻色譜，MWCO：截留分子量，BCA：二辛可寧酸，FACS：熒光激活細胞分選，MHC：主要組織相容性復合物，HLA-II (DR)：人類白細胞抗原 II – DR 同種型，FT-IR：傅里葉變換紅外光譜。

?

用于設置外泌體分泌環境的細胞培養系統

 

五種類型的細胞，包括人心臟祖細胞、間充質干細胞 (MSCs)、脂肪組織來源的干細胞、單核細胞來源的樹突狀細胞 (DCs) 和 HEK293 細胞，已在 GMP 中應用于外泌體生產。

 

細胞培養采用靜態系統，例如燒瓶（static flask system），以及動態系統，例如生物反應器。使用的兩種靜態燒瓶系統包括立式組織培養瓶和 CellBIND? 表面。CellBIND? 表面經過含氧官能團預處理，具有凈負表面電荷。由于動態監控系統，生物反應器也用于大規模生產，這有利于 GMP 過程 。

 

由于外泌體的大小約為 60-200 nm，因此采用具有分子量截止膜的中空纖維生物反應器系統進行條件培養基 (CM) 收獲。中空纖維生物反應器系統為細胞培養提供動態環境和連續培養基收集系統。收集系統減少了收獲的 CM 體積，有利于下游純化。

 

在該過程中使用了不含動物的和動物來源的解離酶。培養基因細胞來源而異，但可分為無動物成分或動物來源成分。外泌體的GMP工藝可以多方面改進，以獲得更多、更純的外泌體。

 

例如，使用無異源條件培養細胞可以減少倍增時間并導致高外泌體產量和持續去除高達 97% 的污染蛋白。此外，基于 10% 合并人血小板裂解物 (HPL) 的 EV 耗盡培養基，適用于生產人 MSC 衍生的外泌體，因為它保留了特征性的表面標志物表達、細胞形態、活力和體外分化潛力, 可以使用。

 

與生物反應器相比，靜態瓶系統（static flask system）的優點是熟練的勞動力較少。如果培養系統需要特定參數（例如 CO2、O2、pH 值）來控制，那么生物反應器將是一種有吸引力的方法。最常見的解離酶或培養基培養試劑應不含動物，以避免致病源或倫理問題。在一些研究中提到，HPL 顯示出比傳統培養基更大的生物活性。因此，在進一步的臨床應用中將考慮試劑的選擇。

 

外泌體純化系統

 

一般來說，純化分為三個步驟，包括過濾去除細胞碎片、濃縮 CM 以及從濃縮的 CM 中分離外泌體。差速離心是濃縮 CM 和從濃縮 CM 中分離外泌體的常用策略。盡管與蔗糖梯度法相比，差速離心過程中添加的試劑較少，但勞動力和勞動力是差速離心純化的缺點。

 

切向流過濾 (TFF) 是近年來用于濃縮 CM 和純化外泌體的一種替代方法，因為它具有用于大規模純化的時間和勞動力較少的優點。此外，還比較了 TFF 和 UC 的性能。從 TFF 獲得的外泌體表現出比從 UC 獲得的更高的免疫調節效力。

 

此外，來自 TFF 的外泌體的免疫調節效力與親代細胞相似，證實了用其分泌的外泌體替代細胞的合理性。報告顯示，與來自 UC 的外泌體相比，從 TFF 獲得的外泌體中含有更多的可溶性因子，例如細胞因子、DNA、RNA、蛋白質或脂質。

 

在通過 UC 收獲外泌體后觀察到 EV 聚集或破壞，因為 UC 中升高的剪切力可能會破壞外泌體，從而破壞從外泌體釋放的蛋白質。此外，尺寸排阻色譜（SEC）是一種基于尺寸排阻理論開發的用于外泌體純化的方法。與來自 UC 的外泌體相比，在 SEC 純化的外泌體中觀察到鐵蛋白（一種主要的蛋白質復合物污染物）濃度降低了 100 倍 。

 

我們專門探討了是否使用市售的 ExoQuick? 作為純化工藝，但本文討論的其他 GMP 生產工藝均未得到驗證。根據我們未發表的研究結果，使用 ExoQuick? 的純化方法快速方便，但純化后的樣品仍含有來自培養基的污染蛋白；因此，它只適用于研究階段的外泌體制備。

 

外泌體的純化涉及回收率和特異性的標準。一般來說，實現更高的回收率會降低特異性，反之亦然。這是因為更高的特異性應遵循逐步純化程序以去除不純物質。差速離心的優點是可以獲得高純度的外泌體；然而，差速離心的每一步都會損失回收率，并且差速離心的耗時是缺點之一。

 

因此，差速梯度離心克服了外泌體純度的耗時和維持。差速梯度離心的一個缺點是差速試劑的殘留。超濾系統在克服耗時、提高特異性和回收率方面帶來了更具吸引力的特點。然而，蛋白質可能在超濾系統中不穩定，因為 CM 在純化過程中濃縮，因此可能導致滲透壓升高。

 

外泌體表征——物理化學和生物學特性

 

通過 ELISA 和十二烷基硫酸鈉 (SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE) 測定外泌體中蛋白質和蛋白質含量的吸附。另一種使用 BCA 蛋白質測定試劑盒的替代方法已被開發用于蛋白質定量。隨著技術的進步，已經建立了用于分析外泌體成分的微流控電泳分析儀和液相色譜-質譜。為了量化來自母細胞和外泌體標記物（如 CD9、CD63 和 CD81）的胞質蛋白，使用流式細胞術。

 

最近的文獻表明，外泌體的物理化學性質，如粒徑和濃度，可以使用 NanoSight 儀器和透射電子顯微鏡 (TEM) 來觀察外泌體的結構和大小。此外，研究還描述了用于鑒定外泌體的方法，例如磷脂定量、細胞因子定量和免疫調節特性。

 

臨床試驗中的外泌體

 

臨床試驗中應用了兩類外泌體，即植物來源的外泌體和人體標本[圖1]。到目前為止，已經報道了使用人體樣本外泌體完成的臨床試驗結果；相比之下，植物來源的外泌體處于起步階段，尚未在臨床試驗中招募患者。

 

由于外泌體的囊泡結構，使用外泌體作為藥物載體也已在臨床試驗中進行。表2描述了具有完整臨床報告的臨床試驗中應用的外泌體，表3總結了處于招募狀態或非招募狀態的臨床試驗中外泌體的發展。

 

表 2? 臨床試驗中使用的外泌體總結及完整報告結果

 

表3 臨床試驗中使用的外泌體總結（來源：clinical trial.com）

來自人類樣本的外泌體

 

獲得外泌體的三個主要來源，即 DC、MSC 和患者來源的腫瘤細胞，正在接受臨床試驗。外泌體通過超濾或差速離心被純化并加工成濃縮形式，然后是具有緩沖的 UC。通過電子顯微鏡或通過檢測外泌體標記物進行物理表征，例如 CD9、CD81、四跨膜蛋白、熱休克 70 kDa 蛋白 8 (HSC70)、熱休克蛋白 (HSP) 70、HSP90、CD80、細胞間粘附分子 1、CD71、溶酶體相關膜蛋白 3、CD63、Alix 和腫瘤易感基因 101 [表 2]。

 

此外，生物活性的特征在于外泌體來源或通過諸如確定免疫原性的方法。人源性外泌體的應用主要用于癌癥適應癥，部分用于炎癥或慢性疾病。外泌體可以含有腫瘤抗原以誘導患者的抗腫瘤免疫或抗癌藥物以引起細胞毒性以治療癌癥患者。此外，利用具有炎癥調節功能的MSC是一種治療炎癥或慢性疾病的策略。以下部分描述了外泌體應用的詳細信息。

 

癌癥適應癥含有腫瘤抗原的外泌體可在患者體內誘導抗腫瘤免疫

來自 DC 的外泌體可以來自未成熟或成熟的 DC，這些 DC 被細胞因子激活，例如重組干擾素-γ。注射劑量范圍從 8.5 × 10E11 到 4.0 × 10E13 個具有 MHC II 類分子的外泌體。為了誘導被診斷患有癌癥的患者的免疫力，DC衍生的外泌體含有要皮下注射的腫瘤肽。使用未成熟 DC 衍生的外泌體的試驗已應用于黑色素瘤和非小細胞肺癌，其安全性結果相似，但在非小細胞肺癌的情況下，已觀察到 MAGE 特異性 T 細胞反應。

為了促進 T 細胞刺激，已經為患有非小細胞肺癌的患者設計了 DC 成熟策略。然而，一名患者有 3 級肝毒性，只有 32% 的患者經歷了 4 個月以上的無進展生存期穩定，低于 50% 的主要終點。因為腫瘤抗原，如癌胚抗原，可以直接來自癌癥患者，所以從患者的腹水衍生的外泌體被收集。已經報道了 I 期試驗的安全性和良好耐受性，并且在腹水衍生的外泌體加粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子組中觀察到腫瘤特異性抗腫瘤細胞毒性 T 淋巴細胞反應。

含有抗癌藥物的外泌體可引起細胞毒性，用于治療癌癥患者

 

除了攜帶腫瘤抗原外，含有化學藥物或 siRNA 的外泌體已被用于治療癌癥。有兩項臨床試驗（NCT01854866 和 NCT02657460）使用化療藥物治療診斷為惡性胸腔積液的患者。在NCT01854866的臨床前試驗和試驗中，他們分別使用甲氨蝶呤（MTX）和順鉑作為抗癌藥物。當 MTX 在臨床前試驗中用作抗癌藥物時，存活率更高 。在NCT02657460的試驗中，他們使用MTX作為包封抗癌藥，順鉑(cisplatin)作為比較劑。KrasG12D siRNA已被推廣為另一種用于治療轉移性胰腺癌患者的抗癌藥物類型，臨床試驗編號NCT03608631中已提出間充質基質細胞來源的外泌體。

其他適應癥

 

2013 年后很少有臨床試驗使用 DC 衍生的外泌體 [表 2]。MSC 衍生的外泌體在臨床試驗中的應用始于 2014 年 [表 2]，完整的報告于 2016 年提供。大多數使用 MSC 衍生的外泌體的臨床試驗都應用于慢性疾病、免疫疾病和急性缺血性中風。僅報道了使用包裹 KrasG12D siRNA 的 MSC 衍生的外泌體進行的臨床試驗案例。兩項臨床試驗報告了 MSC 衍生的 EV 治療慢性疾病，即慢性腎病和支氣管肺發育不良。由于外泌體的操作程度較低，外泌體的特征可以通過外泌體和MSC標記來確定。

植物來源

 

三種植物來源，即葡萄（NCT01668849）和生姜或蘆薈（NCT03493984），已在同一贊助商路易斯維爾大學的臨床試驗中注冊，但植物源性外泌體的臨床試驗狀態處于未招募階段[表3]。

 

葡萄來源的外泌體的應用是治療由放射和化學療法引起的口腔粘膜炎引起的疾病。在之前的臨床前研究中，科學家Songwen Ju 等人證明葡萄來源的外泌體可以更新腸道組織的過程，并在組織遭受病理損傷時參與組織重塑過程。

 

研究人員Henry Bohler 等人的另一項研究，使用生姜或蘆薈生產外泌體來治療被診斷患有多囊卵巢綜合征的患者，期望它能減輕胰島素抵抗和慢性炎癥（試驗編號 NCT03493984）。此外，科學家唐納德米勒等人，由于分子的疏水性，使用植物來源的外泌體作為疏水性藥物遞送載體包裹姜黃素，用于治療腸道疾病（試驗編號 NCT01294072）。

植物外泌體具有無動物問題和中草藥理論支持基本情景的優勢，但植物的生命周期太長，在外泌體生產和表征方面提供的信息較少。哺乳動物細胞的倍增時間較短，約為 24-48 小時，吸引了臨床試驗的發展。關于植物源性外泌體 GMP 生產的信息較少，但有一些臨床前研究進行了調查。生產過程中動物和植物來源之間的主要區別在于收獲。

動物來源的外泌體是在培養過程中收獲培養基。相反，植物來源的外泌體用于提取質外體囊泡，如葉子、水稻芽、葵花籽和根，或從果汁中提取外泌體樣囊泡。不幸的是，植物來源的外泌體的表征信息較少，特別是特定標記。然而，用于植物來源外泌體表征的最常用方法，如 TEM、納米粒子追蹤分析和 SDS-PAGE，與動物來源外泌體相似。因此，GMP級植物源性外泌體的開發，特別是純化和表征，可以參考動物源性外泌體。

結論

 

植物和人體組織衍生的外泌體已在臨床試驗中注冊。與植物來源的外泌體相比，人體組織來源的外泌體建立起來的報告和數據更完整。大多數研究描述了符合GMP的人體組織來源的外泌體，以滿足臨床試驗的應用要求。通過細胞培養產生的外泌體必須經過外泌體純化和表征。用于細胞培養的基于中空纖維的生物反應器是一種有吸引力的外泌體生產策略，因為可以從過濾的纖維中收獲減少的 CM 體積。此外，UF純化的外泌體避免生物活性蛋白從外泌體的囊泡中釋放，比UC具有更高的益處。生物功能的確定，例如外泌體的生物標志物和來自親代細胞的特性，是在臨床試驗應用之前表征外泌體的兩個主要問題。總體而言，外泌體的開發可能是治療癌癥、炎癥性疾病和慢性疾病等非分層領域疾病的替代候選者。