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細胞外囊泡由所有細胞類型分泌，并與組織穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，可作為疫苗和基因治療平臺以及潛在生物標志物。由于它們的尺寸低于光學顯微鏡的衍射極限，生理條件下的直接可視化的這種納米級的單個粒子具有阻礙。來自美國北卡羅來納大學的研究人員開發(fā)了一種基于直接隨機光學重建顯微鏡的單個細胞外囊泡的三維成像方法，并鑒定了表面相關(guān)標志物。該研究發(fā)表于J Extracell Vesicles雜志上。?

外泌體是細胞外囊泡 (EV) 的一種。它們與其他較大的 EV 類型的區(qū)別在于它們的尺寸（通常直徑約為 30-200 nm）以及它們的生物發(fā)生途徑。外泌體源于細胞內(nèi)部，從晚期內(nèi)體向內(nèi)出芽進入多泡體 (MVB)。內(nèi)陷的內(nèi)體富含轉(zhuǎn)運所需的內(nèi)體分選復合物 (ESCRT)、四次跨膜蛋白和脂筏相關(guān)蛋白。然后 MVB 運輸?shù)劫|(zhì)膜釋放出外泌體。許多外泌體蛋白質(zhì)和特征與質(zhì)膜衍生的脫落微泡是相似的。這些蛋白包括四次跨膜蛋白 CD9、CD63 和 CD81。當然，一些研究認為各種EV在蛋白質(zhì)組成和大小方面也具有異質(zhì)性。

EV是進化上保守的細胞間通信網(wǎng)絡的一部分，對于維持組織和機體穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。EV 的內(nèi)容物會因細胞狀態(tài)而改變，在病毒感染和腫瘤發(fā)生時能觀察到EV的一些變化。EV內(nèi)容物向鄰近或遠處受體細胞的傳遞已被證明會影響細胞分化、轉(zhuǎn)錄、遷移、增殖、代謝狀態(tài)和疾病進展。EV在細胞之間轉(zhuǎn)移小代謝物、mRNA、miRNA、蛋白質(zhì)甚至整個病毒。EV會因藥物和人類疾病而改變。近年來，人們對EV作為小分子、RNA和蛋白質(zhì)的傳遞劑、疾病的生物標志物和疫苗平臺產(chǎn)生濃厚興趣。然而，我們對EV的結(jié)構(gòu)仍知之甚少。

生物學研究和藥物應用取決于徹底表征和均質(zhì)EV制劑。最重要的 EV 衡量標準是數(shù)量和規(guī)模。然而，EV太小而無法通過傳統(tǒng)的光學顯微鏡觀察到。這是該領(lǐng)域廣泛認可的主要障礙。電子顯微鏡(EM) 代表了納米粒子研究領(lǐng)域的標準，也已應用于EV。然而，許多 EM 制備方法采用脫水步驟，可能會改變?nèi)魏我后w囊泡的三維 (3-D) 形狀。動態(tài)光散射、納米粒子跟蹤分析 (NTA) 和最近的納米級流式細胞術(shù)等技術(shù)經(jīng)常將EV分析結(jié)果作為單一的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。這些方法在識別EV亞群方面可能受到限制，并且無法檢測 EV 表面的標記聚類。這些方法中的大多數(shù)不如直接隨機光學重建顯微鏡 (dSTORM) 敏感，并且可能會錯過僅具有單個表面標記分子的EV種群。為了解決這一障礙，研究團隊采用了多色 3-D 超分辨率顯微鏡來測量溶液中的單個EV并定位其表面的蛋白質(zhì)。

開發(fā)了超分辨率顯微鏡可以用于可視化低于衍射極限（~ 250 nm）的物體。這包括多種技術(shù)模式。dSTORM依賴于對單個光開關(guān)事件的分析來繞過衍射極限。值得注意的是，dSTORM 不需要固定。EV 的分離以及測量是在生理條件（滲透壓、pH、溫度）下進行的。在這項研究里，研究人員在每個視野中以 3-D 形式對數(shù)百個單獨的 EV 進行了可視化，對單個粒子進行了精確測量，基于四次跨膜蛋白標記（CD81 和 CD9）對亞群進行了定量，并在單個單個粒子的表面上定位了四次跨膜蛋白復合物。這些數(shù)據(jù)為EV表面存在微區(qū)提供了直接證據(jù)，并且Cryo-EM證實了這些微區(qū)的存在。這項研究中的單個粒子可視化提供了對 EV 的異質(zhì)性、結(jié)構(gòu)和復雜性的深入了解，而這些都是以前未被認識的。?

參考文獻：Imaging of surface microdomains on individual extracellular vesiclesin 3-D. J Extracell Vesicles. 2022 Mar;11(3):e12191.

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