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外泌體是大多數細胞分泌的一種微小囊泡。它具有脂質雙層結構，分布在外周血、尿液、唾液、腹水、羊水和其他體液中。外泌體攜帶蛋白質、脂質、核酸等重要信息，尤其是非編碼RNA（miRNA、lncRNA、circRNA等），使其更有意義。外泌體不僅在細胞間物質和信息傳遞中發揮重要作用，而且有望成為多種疾病的早期診斷標志物。外泌體RNA測序可以快速高效地獲得外泌體RNA的全面信息，是疾病診斷和隨訪的理想手段。目前，基于外泌體的RNA研究主要集中在miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA等類型。

????關于外泌體分離方法，包括傳統的差速離心、密度梯度離心，以及后來開發的超濾、聚合物沉淀、免疫分離、分離篩選、體積排阻色譜等。

細胞外囊泡（EV）生物發生、亞群、外泌體分離方法（Karim Sidhom?等人，2020 年）

一、差示超速離心

????差速離心仍然是最常見的外泌體分離技術之一。該方法包括幾個步驟，包括：

??? 1.低速離心以去除細胞和凋亡片段。

??? 2更高速的離心以消除較大的囊泡。

??? 3高速離心沉淀外泌體。

????可以從細胞培養上清液、血清、血漿、尿液、腦脊液和其他體液（腹水、羊水、乳液、唾液等）中提取外泌體，得到的高純度外泌體顆粒可用于后續的NTA、TEM、WB分析等。

二、體積排阻色譜（SEC）

????根據體積排阻色譜法，SEC根據大小而不是分子量分離大分子。該技術使用填充有多孔聚合物微球的色譜柱。分子根據其直徑在微球中移動。半徑較小的分子需要更長的時間才能通過色譜柱的孔隙遷移，而較大的分子則更早地從色譜柱中洗脫出來。SEC已被證明比離心具有更多優勢，因為通過色譜分離的外泌體不受剪切力的影響。目前，SEC是一種被廣泛接受的從血液和尿液中分離外泌體的技術。我們有一套基于色譜法的標準程序用于外泌體的提取和純化，以確保高回收率。

三、基于聚乙二醇（PEG）的沉淀

????生物體液中的外泌體沉淀可以通過改變其溶解度或分散性來實現。通常，樣品與含有PEG的沉淀溶液一起孵育，該沉淀溶液迫使可溶性較低的組分從溶液中排出。含有外泌體的沉淀在孵育過夜后通過低速離心或過濾分離。該方法易于使用，不需要專門的設備，而且可以針對大量樣品進行擴展。可根據您的要求提供多種沉淀套件。

四、密度梯度離心（DGC）

????密度梯度離心是指超離心與蔗糖密度梯度相結合，實現外泌體與非囊泡顆粒（如蛋白質和蛋白質/RNA聚集體）的分離。因此，該方法將囊泡與不同密度的顆粒分離，并能夠提取低含量的外泌體。然而，適當的離心時間很重要，否則，如果外泌體具有相似的密度，它們仍然可以在外泌體中找到污染物顆粒。

五、免疫親和力（IA）

????使用涂有抗體的磁珠進行免疫親和捕獲，抗體靶向外泌體表面蛋白以分離特定的囊泡群。實驗程序包括樣品處理、磁珠孵育和結合、低速離心和分離外泌體的生物學分析。

六、微流體（MF）

????微流體（MF）技術使用具有特異性抗體介導結合的芯片來捕獲外泌體?；谖⒘黧w的技術可用于具有特定表面標志物的外泌體分離（微流體與免疫親和捕獲相結合）和具有特定大小群體的外泌體分離（微流體結合膜過濾）。

七、超濾

????超濾（UF）依賴于具有不同孔徑的過濾器，該過濾器用于將外泌體與蛋白質和其他大分子分離。

文獻：

1.Karim Sidhom, et al. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option? Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 6466.

2.Yong Kyoung Yoo, et al. Toward exosome-based neuronal diagnostic devices. Micromachines (Basel). 2018, 9(12): 634.

3.Kang Li, et al. Cushioned-density gradient ultracentrifugation (C-DGUC): a refined and high performance method for the isolation, characterization, and use of exosomes. Methods Mol Biol. 2018, 1740: 69-83.

4.Shang-Chun Guo et al. Microfluidics-based on-a-chip systems for isolating and analysing extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2018, 7(1): 1508271.

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