干細胞外泌體的應(yīng)用

外泌體在美容抗衰、藥物治療、遞送載體、體外診斷和科研試劑方面有著廣闊的應(yīng)用前景，其中美容護膚抗衰產(chǎn)品已率先實現(xiàn)了商業(yè)化。本章將詳細闡述：天然外泌體療法、工程化外泌體遞送。

1.?天然外泌體療法

干細胞由于其旁分泌機制發(fā)揮治療作用成為再生應(yīng)用中最流行的外泌體細胞源。間充質(zhì)干細胞、胚胎誘導(dǎo)的多能干細胞、組織特異性干細胞、初級前體和成熟細胞等分泌的外泌體都有案例成功應(yīng)用于再生治療中。同時，科學(xué)家也發(fā)現(xiàn)免疫細胞來源和腫瘤細胞來源的外泌體可用于腫瘤免疫治療和開發(fā)腫瘤疫苗。

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表1?天然外泌體療法全球臨床進展

2021年3月，美國FDA批準Direct Biologics公司的干細胞外泌體藥物ExoFlo?的IND申請，順利進入臨床I/II期試驗。它是從人骨髓間充質(zhì)干細胞中分離出來的細胞外囊泡型生物產(chǎn)品——外泌體，首發(fā)適應(yīng)癥為治療中度至重度新型冠狀病毒感染和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。根據(jù)Direct Biologics公司披露，ExoFlo?的II期臨床沒有出現(xiàn)不良事件(AE)和重大不良事件(SAE)；ExoFlo-15ml組的死亡率具有統(tǒng)計學(xué)意義上的降低，與安慰劑組相比，在18-65歲的呼吸衰竭患者中，絕對和相對風(fēng)險分別降低了30.8%和61.6%；在18-65歲的ARDS患者中，死亡的絕對風(fēng)險和相對風(fēng)險分別降低了41.9%和57.7%。2022年7月，ExoFlo?進入臨床III期試驗，2023年1月，ExoFlo?完成了400例患者的臨床III期臨床入組，是美國FDA首次批準應(yīng)用干細胞外泌體用于疾病治療的重大里程碑。ExoFlo?除了新冠感染治療和ARDS適應(yīng)癥外，其他適應(yīng)癥包括克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、器官移植排斥、下腰痛，處于臨床I期試驗階段。

Direct Biologics公司認為ExoFlo?的成功源自公司的cGMP放大工藝和無菌工藝獲得了超純無菌外泌體；每毫升可提供超過100億個外泌體帶來了優(yōu)異的功效；完美的質(zhì)量控制使每一瓶外泌體都具有質(zhì)量一致性。

西比曼的haMPC-Exos用于肺部感染處于IIT研究，入組了60例志愿者，正在瑞金醫(yī)院開展（NCT04544215）。

肺損傷相關(guān)實驗研究表明，干細胞外泌體具有積極的治療作用。Vitti Labs的外泌體藥物EV-Pure用于治療肺纖維化和女性生殖障礙/原發(fā)性卵巢功能不全適應(yīng)癥已經(jīng)于2022年10月進入臨床I期（NCT05387239）。

干細胞外泌體的心臟保護機制已成為研究熱點，越來越多的研究證實，干細胞外泌體具有與干細胞相似的心臟保護功能，能顯著提高心肌細胞的存活率、抗心肌細胞損傷、促進新生血管形成、改善心臟功能、抗炎、抗心肌細胞凋亡、促進心肌細胞再生。外泌體具有較好的穩(wěn)定性，較少引起受體細胞的突變以及免疫排斥反應(yīng)，有望成為治療心血管疾病的有效方法。

間充質(zhì)干細胞外泌體在治療心血管疾病如心肌梗死和心力衰竭方面具有巨大的潛力?！禨tem Cells journals》發(fā)表了相關(guān)綜述，討論了間充質(zhì)干細胞外泌體促血管生成、增強其生物活性改善心臟組織修復(fù)的方法。2022年4月，由Tehran University of Medical Sciences發(fā)起的Mitochondria and MSC-derived exosomes用于治療心肌梗塞的臨床試驗正式開展，入組了20例志愿者來評估療效（NCT05669144）。

間充質(zhì)干細胞外泌體在缺血性心臟病中具有很好的療效。發(fā)表在《BioMed Res》雜志的研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞外泌體的注入抑制了缺血性心臟病疾病模型大鼠的心臟的纖維化和炎癥反應(yīng)，并且明顯改善了心臟的功能。2021年9月，伊斯法罕醫(yī)科大學(xué)的最新臨床研究（NCT03384433）通過5例患者探索了攜帶miR-124的間充質(zhì)干細胞外泌體對缺血性心臟病的臨床治療作用。

肝臟疾病相關(guān)實驗研究表明，干細胞外泌體具有保護和治療作用，Du等研究證明干細胞外泌體通過激活SPhks和s1p信號通路保護肝臟免受肝缺血/再灌注損傷，促進細胞增殖；Li等研究發(fā)現(xiàn)干細胞外泌體可以通過抑制肝細胞上皮間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)移和膠原蛋白的生成來改善肝纖維化。

腎損傷相關(guān)實驗研究表明，外泌體中攜帶的miRNA和蛋白能夠減輕腎缺血/再灌注損傷，減少細胞凋亡，促進細胞增殖，從而修復(fù)腎損傷。2022年4月，ILIAS Biologics公司的外泌體藥物ILB-202進入了臨床I期，靶向NF-κB用于治療急性腎損傷。

外泌體可在淚液、房水、玻璃體液、血液等眼部體液中穩(wěn)定存在，在調(diào)節(jié)眼部細胞遷移、增生、凋亡、免疫反應(yīng)、血管生成等方面發(fā)揮重要作用，與角膜損傷、糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性白內(nèi)障、青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性、葡萄膜黑色素瘤等眼病關(guān)系密切。

圖2.?外泌體在腫瘤免疫中的功能

免疫細胞來源的外泌體能夠介導(dǎo)和調(diào)節(jié)機體對腫瘤的免疫反應(yīng)，外泌體在腫瘤免疫治療方面的潛力受到廣泛關(guān)注。樹枝狀細胞（DC）產(chǎn)生的外泌體包含大量的MHC-多肽復(fù)合物和免疫刺激相關(guān)的分子，能夠激活相關(guān)的T細胞，介導(dǎo)體內(nèi)抗腫瘤應(yīng)答，在多個臨床試驗中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤療效。CAR-T細胞來源的EVs表達高水平的穿孔素和顆粒酶B以及CAR，誘導(dǎo)表達其同源抗原的腫瘤細胞死亡，EV由于體積小，能夠跨越生物屏障，可以有效地穿透實體腫瘤，該文章CAR-T-Derived Extracellular Vesicles: A Promising Development of CAR-T Anti-Tumor Therapy發(fā)表于《Cancer》(Cancers?2023,?15(4), 1052)。

圖3.??T淋巴細胞衍生的細胞外囊泡參與免疫反應(yīng)

骨關(guān)節(jié)炎是臨床常見病，以關(guān)節(jié)軟骨損傷、軟骨下骨硬化、滑膜炎癥等為特征。近年來大量研究表明，干細胞外泌體具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、促進組織修復(fù)和再生等作用，是治療骨關(guān)節(jié)炎和軟骨損傷的新療法，不同干細胞來源的外泌體對骨關(guān)節(jié)炎均能起到保護和治療的作用。SF-MSC-EX用于治療軟骨損傷處于臨床II期試驗階段（?NCT05261360），該試驗于2022年3月開展，入組受試者30例。Cells for Cells的CelliStem OA-sEV處于臨床I期，用于治療膝骨關(guān)節(jié)炎。四川大學(xué)華西醫(yī)院的Autologous AdMSC-Exo治療骨關(guān)節(jié)炎已開展IIT研究。

干細胞外泌體可以用于治療腦卒中、糖尿病、卵巢早衰、克羅恩病、腸易激、皮膚相關(guān)疾病、移植物抗宿主病、傷口愈合等疾病。

2.2? 工程化外泌體遞送

外泌體的作用不斷被發(fā)掘，廣泛作為藥物、醫(yī)美護膚、疫苗的遞送載體。外泌體載體作為“新型納米遞送系統(tǒng)”，綜合了細胞藥物遞送和納米技術(shù)的優(yōu)勢，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就備受學(xué)術(shù)界和工業(yè)界關(guān)注。

外泌體作為遞送載體具有諸多優(yōu)勢：a. 具有天然的靶向能力，通過工程化修飾，可靶向到特定的組織和器官，解決傳統(tǒng)遞送系統(tǒng)難以解決的靶向問題；b. 無免疫原性，包裹的核酸藥物不易降解，降低藥物全身暴露毒性；c. 外泌體是納米級的，并攜帶細胞表面分子，具有克服生物屏障的能力；d. 可跨越血腦屏障，實現(xiàn)顱內(nèi)藥物遞送；e. 奶源外泌體可將易降解藥物制成口服制劑；f. 外泌體更容易儲存；g. 作為天然納米顆?？山档桶踩L(fēng)險（相關(guān)閱讀：納米遞送系統(tǒng)行業(yè)研究報告）。

表2. 工程化外泌體全球臨床進展

圖4.?CD24/Siglec-10信號通路

CD24與巨噬細胞上的Siglec-10互相作用，可抑制巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬，敲除CD24或Siglec-10，將促進巨噬細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。CD24被認為是一種新型腫瘤免疫靶點，與明星分子CD47一樣，也是一種腫瘤細胞“別吃我”信號蛋白。

exoIL-12?和exoSTING?由Codiak BioSciences研發(fā)，是基于該公司工程化外泌體技術(shù)平臺engEx? PLATFORM開發(fā)的兩款產(chǎn)品，也是全球最先進入臨床的工程化外泌體遞送藥物。該平臺使用PTGFRN和BASP1作為支架蛋白，將靶向配體或治療分子安裝到外泌體的表面PTGFRN蛋白上或腔內(nèi)BASP1蛋白上，達到運輸至靶組織靶細胞和治療疾病的作用。

圖5.?engEx? PLATFORM外泌體遞送平臺

exoIL-12?是一種外泌體治療候選藥物，通過外泌體支架蛋白PTGRFN在表面展示完全活性形式的IL-12?；厮輾v史，白介素類產(chǎn)品通過激活T細胞和NK細胞具有強大的抗腫瘤免疫反應(yīng)，但由于無法在局部持續(xù)保留、全身暴露引起嚴重不良事件，導(dǎo)致多個臨床試驗失敗，特別是在剛剛過去的2022年，所以Codiak在外泌體全新領(lǐng)域再疊加風(fēng)險極高的IL-12或?qū)磔^大的研發(fā)風(fēng)險。

exoIL-12?適應(yīng)癥為皮膚T細胞淋巴瘤（CTCL），給藥途徑為瘤內(nèi)注射。2020年12月，Codiak公布臨床Ⅰ期試驗達到了主要終點，55例健康志愿者中顯示出良好的安全性和耐受性，沒有局部或系統(tǒng)治療相關(guān)的不良事件，也沒有檢測到IL-12的全身性暴露。2022年6月，Codiak公布CTCL試驗部分，2例患者均得到治療，每位患者在多個腫瘤病變處接受了20余次exoIL-12注射(6.0 μg)，治療時間大于6個月，未觀察到3級及以上治療相關(guān)不良事件。患者001表現(xiàn)出部分緩解，疾病負擔(dān)減少61%，注射和未注射的所有皮膚病變CAILS評分的改善范圍為20-80%，治療醫(yī)生認為不需要再注射。患者002注射了20次，疾病負擔(dān)降低了43%，注射和未注射的所有病變的CAILS評分均有30-50%的改善。披露數(shù)據(jù)結(jié)果的同時宣布將于2023年第一季度啟動II期試驗，但2022年8月公司突然公告暫停exoIL-12?的臨床II期，具體原因未披露。

圖6.exoIL-12?的結(jié)構(gòu)

exoSTING?是將STING激動劑納入外泌體腔內(nèi)，同時在外泌體表面表達高水平的PTGFRN蛋白，以促進腫瘤抗原提呈細胞的特異性攝取。該產(chǎn)品依然通過瘤內(nèi)注射方式治療頭頸部鱗狀細胞癌、三陰性乳腺癌、甲狀腺間變性癌、皮膚鱗狀細胞癌，2022年9月完成27例志愿者參與的臨床I/II期試驗。在所有劑量隊列中，exoSTING耐受性良好，未觀察到三級或更高級別的劑量限制毒性或治療緊急不良事件，但在3例患者中觀察到與治療相關(guān)的不良事件(TRSAE)——2例二級細胞因子釋放綜合征、1例一級發(fā)熱。在注射腫瘤和遠端非注射腫瘤中觀察到抗腫瘤活性的跡象。數(shù)據(jù)支持將exoSTING推進到II期臨床，特別是在早期疾病中，與免疫治療結(jié)合可能療效增強。公司計劃2023年第一季度啟動臨床II期試驗，但2022年8月公司突然公告暫停exoSTING?項目。

圖7.?exoSTING?的結(jié)構(gòu)