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前言

工程化過繼細胞療法（ACT）的出現改變了血液腫瘤的治療格局，也為實體瘤的治療帶來了希望。然而，細胞療法在實體瘤中的應用受到腫瘤遷移不良、滲透物理屏障和腫瘤主動抑制的影響。

因此，將內源性或過繼轉移的淋巴細胞精確引導進入實體腫瘤腫塊是實現最佳抗腫瘤效果的必要條件，同時也將提高患者的安全性。

實體瘤：CAR-T和CAR-NK的對策

迄今為止，人們已經進行了許多探索和嘗試，出現了許多策略，這些策略可用于增強實體瘤免疫治療中過繼轉移細胞（包括CAR-NK和CAR-T細胞）的遷移和滲透。

趨化因子及其受體

趨化因子是一種細胞因子，調節免疫細胞的遷移和運輸。趨化梯度對于將效應細胞招募到炎癥部位，包括腫瘤微環境（TME）至關重要。實體瘤的趨化因子表達由基質細胞、腫瘤細胞和腫瘤相關免疫細胞分泌，以決定哪些免疫細胞被招募到TME，從而幫助或阻礙腫瘤生長。

多種趨化因子/趨化因子受體策略已用于免疫治療性T細胞臨床前研究，以促進CAR-T細胞靶向腫瘤，包括利用CXCR3、CXCR2、CCR5、CCR2和CCR3軸。目前還沒有獲得批準的癌癥趨化因子免疫治療策略，但多個研究顯示其具有良好的臨床潛力。

CXCR3

CXCR3軸是實體瘤免疫細胞募集的關鍵途徑，CXCR3的配體包括CXCL9、CXCL10和CXCL11。激活后，CXCR3在效應器TH1極化的CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK細胞和NKT細胞上誘導并高表達，腫瘤中CXCR3配體的表達、血清CXCR3配體水平的升高以及T細胞上的CXCR3增強了T細胞的募集，并在一系列癌癥中獲得了積極的臨床前結果。

溶瘤痘苗病毒在間皮瘤小鼠模型中對CXCL11的腫瘤局部表達成功地增加了內源性細胞毒性T淋巴細胞向腫瘤的轉運，并誘導了系統性抗腫瘤免疫，突出了CXCR3軸對淋巴細胞遷移的重要性。此外，表觀遺傳調節劑（DNA甲基化和H3K27三甲基化抑制劑）的使用恢復了CXCL9和CXCL10的腫瘤表達，提高了卵巢癌小鼠模型中的CAR-T細胞效率，改善了T細胞浸潤和腫瘤生長控制。在小鼠骨髓瘤模型中，將編碼CXCL10和IL-18的兩種溶瘤腺病毒聯合注射到已建立的腫瘤中，可導致腫瘤生長變小，80%的小鼠腫瘤完全消退。

CXCR2

在一系列腫瘤模型中，T細胞上CXCR2表達的調節已被證明能提高治療效果。CXCR2對多種腫瘤上過表達的配體具有特異性，包括CXCL1、CXCL2、CXCL5和CXCL8。這些配體也由各種浸潤性免疫細胞表達，通常被認為是促腫瘤趨化因子。例如，CXCL8可直接促進侵襲和轉移，并可通過招募粒細胞源性抑制細胞和中性粒細胞來促進促轉移生態位。利用促腫瘤細胞因子表達的一種策略是在理想的效應細胞上異位表達其受體，如CXCR2，從而將其靶向腫瘤。

原代T細胞中CXCR2的表達增強了黑色素瘤小鼠模型腫瘤中T細胞的積累，改善了腫瘤的消退和存活。一項正在進行的I/II期試驗旨在用CXCR2轉導的腫瘤浸潤淋巴細胞治療轉移性黑色素瘤患者，隨后進行高劑量IL-2治療，目前臨床結果報告尚未公布（NCT01740557）。CXCR2表達在CAR-T細胞治療中也顯示出了應用前景。在肝細胞癌腫瘤模型中，CAR-T細胞上CXCR2的強制表達增加了腫瘤內的遷移和積聚，改善了治療結果。類似地，CXCR1或CXCR2的異位表達增強了向腫瘤的轉移，并在膠質母細胞瘤、胰腺癌和卵巢癌模型中誘導腫瘤消退并提高了生存率。

CCR4

受體CCR4在CD8+T細胞上低表達，其配體為CCL22和CCL17。在霍奇金淋巴瘤小鼠模型中，通過逆轉錄病毒轉導抗CD30 CAR-T細胞增強CCR4的表達，增強了體外向淋巴瘤細胞的遷移，并提高了CAR-T細胞治療的效果。盡管這項研究使用了血液癌癥模型，但這種方法也可以應用于實體瘤，因為在胃腸道癌、卵巢癌和胰腺癌中發現了CCL22和/或CCL17表達上調。在胰腺癌小鼠模型中，用CCR4對抗原特異性細胞毒性T細胞進行逆轉錄病毒轉導，增強了向腫瘤部位的遷移，并消除了40%小鼠的腫瘤。有趣的是，研究表明，CCR4修飾增強了與DC的相互作用，增強了T細胞LFA-1與DC ICAM-1的結合。因此，這種策略不僅有可能增強腫瘤的浸潤，還可能增強腫瘤內部免疫細胞的激活和支持。

CCL2

CCL2由一系列腫瘤和支持腫瘤的免疫細胞分泌，并誘導促腫瘤免疫細胞（如巨噬細胞、TH2和調節性T細胞）的遷移。然而，其同源受體CCR2b僅在活化的T細胞上弱表達。與不表達CCR2b的CAR-T細胞相比，表達CCR2b的GDH-CAR-T細胞上向分泌CCL2的神經母細胞瘤的轉運增強了10倍，并增加了相對抗腫瘤活性。然而，靶向CCL2途徑可能會產生一些意外的毒性后果，因為CCL2在一系列非腫瘤細胞類型表達，包括內皮細胞、平滑肌和成纖維細胞，并且與多種疾病有關，例如類風濕性關節炎、哮喘、炎性腸病和SARS-CoV-2感染。考慮到腫瘤產生的CCL2水平高于正常組織，CCR2b轉導的CAR-T細胞尚需通過實驗進行評估。

CXCR4

趨化因子受體CXCR4廣泛表達于多種血液腫瘤和實體瘤。其與對應配體CXCL12（SDF1）的結合促進腫瘤細胞增殖、存活和轉移。對CXCR4的抑制導致T細胞和NK細胞浸潤增強，同時癌相關成纖維細胞（CAF）的募集減少。因此，抑制CXCR4是增強CAR-T和CAR-NK細胞向腫瘤部位浸潤的潛在策略。

最近的研究表明，聯合使用抗EGFRvIII CAR-T細胞和PARP抑制劑olaparib可提高療效。olaparib可減少CAF分泌CXCL12，從而減少MDSC的遷移和浸潤，提高乳腺癌小鼠模型中CAR-T細胞治療的效果。

CCL5

CCL5由一系列趨化因子受體識別，這些受體表達在激活的T細胞上，如CCR1、CCR3和CCR5，使CCL5成為腫瘤特異性表達的良好候選，以促進過繼轉移的淋巴細胞遷移。CCL5武裝的溶瘤病毒和CAR-T細胞療法已成功用于神經母細胞瘤小鼠模型。

在NK細胞治療的臨床前小鼠模型中，利用CCL5軸也被證明能提高療效。注入的NK細胞被設計為過表達CCR5，并在腫瘤內注射攜帶CCL5的痘苗病毒，導致NK細胞浸潤增加和腫瘤消退。

盡管趨化因子的調節在免疫治療模型中已顯示出前景，但仍存在嚴重的應用問題，可能會限制其療效。一個重要的考慮因素是，大多數趨化因子可能存在非特異性招募。例如，盡管CCL5可以通過招募T、NK和DC細胞等CCR5+細胞來增強抗腫瘤免疫反應，但它也可以招募單核細胞、巨噬細胞和調節性T細胞，并促進癌癥侵襲。總之，需要明確所選趨化因子的作用，以防止抑制細胞意外招募到腫瘤中。

?溶瘤病毒

溶瘤病毒（OV）具有重要的免疫調節作用，有可能與過繼細胞治療一起用于組合策略。OVs調節TME并影響宿主抗腫瘤免疫反應的能力為使用OVs靶向CAR-T細胞治療腫瘤提供了強有力的理論依據。在機制上，OVs誘導腫瘤細胞的免疫原性細胞死亡，釋放損傷和病原體相關的分子模式（DAMP和PAMP）、腫瘤相關抗原或新抗原，并在腫瘤部位誘導細胞因子和趨化因子表達。OVs可以在腫瘤細胞上誘導主要組織相容性復合體（MHC）的表達，從而增加抗原呈遞。此外，OV介導的TME重塑影響先天性和適應性免疫細胞功能，增強樹突狀細胞激活、淋巴細胞浸潤和激活，并刺激表位擴散。

除了OVs的自然免疫調節外，它們的基因修飾允許腫瘤局部表達廣泛的多肽或非編碼RNA，以進一步增強腫瘤的炎癥特征，支持免疫細胞遷移和激活。在一系列臨床前研究中，攜帶一系列細胞因子、趨化因子和雙特異性T細胞接合器的OV已被用于重塑TME，并提高了CAR-T細胞治療效果。TILT-123是一種攜帶TNF-α和IL-2的溶瘤腺病毒，具有與CAR-T細胞組合策略的潛力。在一系列臨床前模型中與PD-L1抑制顯示出令人信服的協同作用，TILT-123目前正在招募兩個臨床試驗進行臨床研究，作為單藥或與腫瘤浸潤淋巴細胞聯合治療轉移性黑色素瘤（NCT04695327，NCT04217473）。

OV與CAR-T細胞療法的另一種用途是利用轉基因OV誘導腫瘤中的靶抗原表達。這一原理已在臨床前研究中得到證實， CD19抗原通過OV載體展示在實體腫瘤細胞表面，從而通過抗CD19 CAR-T細胞療法實現有效靶向。目前有兩項I期臨床試驗（NCT01953900，NCT03740256），正在測試溶瘤病毒和CAR-T細胞治療實體瘤的協同作用。

腫瘤誘導啟動子

除了基因的組成性表達已被用于增強CAR-T細胞治療外，還可以通過使用可誘導啟動子系統特異性表達腫瘤的靶向性基因。通過腫瘤抗原觸發炎癥介質（包括趨化因子）的位點特異性釋放是鼓勵其他CAR-T細胞和旁觀者細胞向腫瘤遷移的有用方式。

通過識別腫瘤抗原激活的可誘導啟動子，無論是通過T細胞或TIL中的CAR或TCR，已被用于過表達多種基因，尤其是抗腫瘤細胞因子，并已被證明在提高安全性的同時增強了抗腫瘤效果。

IL-12已被證明能增強體內CAR-T細胞活性，但IL-12的毒性也很明顯。靶向表達的臨床前測試主要包括基于IL-2的NFAT啟動子，將IL-12表達靶向腫瘤部位。使用這些抗原觸發的啟動子將IL-12表達固定在腫瘤部位，可提高體內CAR-T細胞對腫瘤的殺傷作用，并減少有效殺傷腫瘤所需的CAR-T細胞數量。該策略將IL-12表達觀察到的全身毒性降至最低。CAR-T細胞局部表達IL-12也被證明能激活腫瘤部位的固有免疫細胞，如巨噬細胞，有助于消除抗原陰性的腫瘤細胞。

NFAT誘導啟動子在非CAR-ACT中也顯示出優勢，例如TCR和TIL-ACT。與非工程化TIL相比，在腫瘤部位選擇性表達IL-12的TIL產生了增強的抗腫瘤免疫反應，并且在轉移性黑色素瘤的臨床試驗（NCT01236573）中所需劑量降低了10到100倍。雖然觀察到了一些毒性，但它使用的誘導系統在人類治療中展現出了應用潛力。

對于非TAA的信號作出反應的啟動子的開發是另一個正在發展的研究領域，可以利用腫瘤代謝物特征的改變。有研究利用CMV啟動子內的缺氧誘導元件開發了一種缺氧腫瘤微環境傳感器。“HiTA系統”將CAR-T細胞基因表達限制在低氧環境中，而忽略了表達TAA的常氧組織。缺氧誘導表達系統也可用于表達其他轉基因或CAR本身，以聚焦和增強免疫反應。

CAR結構的改造

CAR結構的選擇和設計是優化遷移和抗腫瘤活性的關鍵考量因素。Dual CARs和Universal CARs（UniCAR）等系統是改善CAR-T細胞腫瘤靶向性和安全性的有效方法。

Dual CAR-T細胞表達針對不同抗原的CAR，可以在單個T細胞上表達一個以上的CAR或者用兩組不同CAR結構轉導的T細胞，以實現對多種抗原的靶向。這些方法已成功應用于一系列體內實體瘤的臨床治療，在臨床試驗中表現良好的結果。如通過體內靶向CD38和BCMA，組合兩個獨立的CAR-T細胞在臨床已成功治療多發性骨髓癌，客觀緩解率達到87.5%，在隨訪近1年后，有76.9%的患者未出現復發轉移。另外，針對CD19/CD22的雙靶點CAR-T也進入臨床試驗（NCT03233854）。早期結果顯示，88%的患者都能成功緩解，且全部完全緩解；21名LBCL患者中，62%的患者有反應，有29%的患者完全緩解。

UniCAR通過引入第二個組件，稱為靶向模塊（TM），為臨床控制免疫反應創造了一個安全“開關”。TMs是UniCAR-T細胞靶抗原與TAA結合域（例如單鏈抗體）的融合蛋白分子，TMs將CAR與TAA連接起來，由于TM半衰期短（15–45分鐘），去除TM可迅速消除UniCAR-T細胞活性。

目前，幾個UniCAR系統已經進入臨床試驗階段，幾乎所有系統都專注于針對一系列靶點的血液惡性腫瘤，包括CD19（NCT02808442和NCT02746952）、CD22（NCT04150497）和CD123（NCT03190278）。雖然CD19試驗在很大程度上取得了成功，67%的患者獲得了完全緩解，但其他試驗，如CD123 UniCAR試驗（NCT04106076），遇到了安全問題。對于實體瘤，只有少數UniCAR臨床試驗注冊，如一項針對前列腺癌中的PMSA的臨床試驗（NCT04633148）。

針對腫瘤微環境

癌相關成纖維細胞是一種表型異質性細胞群，可構建和重塑TME細胞外基質（ECM）。消耗或改變CAF的功能是目前一個深入研究的領域，有可能成為增強ACT和免疫療法的一個有吸引力的選擇。

由于CAF有助于ECM/細胞屏障，因此減少其數量和活性有可能與CAR-T/NK細胞治療產生協同作用，以增加淋巴細胞向腫瘤的遷移。目前已經開發出幾種CAR，它們通過靶向成纖維細胞活化蛋白α（FAP-α）直接消耗CAF發揮抗腫瘤作用。抗FAP-α CAR-T細胞治療已在多種實體瘤的臨床前模型中顯示出令人信服的療效。有兩項利用抗FAP-α CAR-T細胞的臨床試驗，一項已完成的胸膜間皮瘤1期臨床試驗（NCT01722149）和一項利用第四代CAR的1期臨床試驗（NCT03932565）。

另一種不同的策略是去除免疫抑制細胞，如MDSC和TAM。在神經母細胞瘤小鼠模型中，去除腫瘤局部MDSC可提高CAR-T細胞的療效和腫瘤浸潤。通過使用抗葉酸受體β-CAR-T細胞清除TAM，發現內源性腫瘤特異性CD8+T細胞浸潤增加。TAM靶向CAR-T細胞預處理增強了腫瘤特異性抗間皮素CAR-T細胞的療效，使腫瘤消退并延長生存期。

此外，實體瘤通常表現出代謝紊亂，導致免疫抑制代謝物的釋放，包括乳酸、腺苷和活性氧（ROS），這些代謝物可有效抑制淋巴細胞遷移。CAR-T/NK細胞治療與腫瘤代謝抑制劑的聯合可能增強它們向腫瘤的遷移和對腫瘤細胞的殺傷作用。

增強DC細胞活性

樹突狀細胞（DC）有助于T細胞室的穩態、激活和遷移潛能。在過繼性T細胞轉移的同時，使用刺激和增強內源性DC活性的策略將使T細胞參與和激活最大化，鼓勵表位擴散，并以更有利于局部和全身免疫活動的方式改變TME。

Flt3L是動員和擴增DC細胞的關鍵生長因子，工程化的CAR-T細胞分泌Flt3L增加了骨髓和腫瘤中的DC前體細胞，增加了腫瘤內DC分泌IL-12和TNF，并抑制了腫瘤生長。關鍵的是，CAR-T細胞分泌Flt3L同時促進內源性CD8+T細胞腫瘤浸潤，并導致表位擴散，表明使用Flt3L激活了宿主DC細胞，增強了淋巴細胞向實體瘤的遷移。

●● 小結?●●

CAR-T和CAR-NK細胞治療是改善癌癥患者預后的一種非常有前景的方法。雖然它們對血液系統惡性腫瘤很有效，但克服實體瘤依然困難重重。最近，人們將刺激遷移、改善腫瘤微環境和去除腫瘤屏障的藥物與基于CAR-T/NK的治療相結合，以改善CAR-T和NK細胞在實體瘤令人失望的表現。這些策略將為推進針對實體瘤的工程化T細胞和NK細胞治療提供關鍵途徑。

參考文獻：

1.Controlling Cell Trafficking: Addressing Failures in CAR T and NK Cell Therapy of Solid Tumours. Cancers (Basel).?2022Feb; 14(4): 978.

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