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撰文│包孟梅

編輯│畢紫娟

審校│湯紅明

干細(xì)胞治療被譽(yù)為“人類醫(yī)療史上第三次革命”。自20世紀(jì)50年代以來(lái)，這項(xiàng)技術(shù)已在糖尿病、帕金森綜合征、紅斑狼瘡、白血病等多種疾病中進(jìn)行了相應(yīng)治療嘗試。特別是造血干細(xì)胞的應(yīng)用，改善了多種免疫/血液系統(tǒng)疾病的預(yù)后。自2006年以來(lái)，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent?stem cell，iPSC）的制備技術(shù)及其應(yīng)用，將干細(xì)胞治療帶入了一個(gè)全新時(shí)代。隨著分子生物學(xué)技術(shù)，特別是基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，基因修飾在干細(xì)胞治療中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，并為多種疾病的治療帶來(lái)希望。本文將概述基因編輯技術(shù)在干細(xì)胞治療中的應(yīng)用。

一、CRISPR/Cas9具有廣闊的應(yīng)用前景

基因編輯是一種在基因組上產(chǎn)生目的序列缺失/插入/替換的技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)造成DNA雙鏈斷裂，誘導(dǎo)DNA修復(fù)，從而進(jìn)行目的基因編輯。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)相較于第一代鋅指核酸酶和第二代類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶編輯技術(shù)具有明顯優(yōu)勢(shì)。CRISPR/Cas9依賴的內(nèi)切酶Cas9含有2個(gè)切割結(jié)構(gòu)域——RuvC和HNH，具有切割核酸雙鏈能力。同時(shí)，其識(shí)別序列為單鏈RNA，而非氨基酸鏈，結(jié)構(gòu)較前兩代精簡(jiǎn)，效率提高的同時(shí)成本更低。CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)揮作用時(shí)，具有識(shí)別作用的sgRNA與目標(biāo)序列互補(bǔ)結(jié)合，Cas9則在PAM序列上游的3-5bp處進(jìn)行雙鏈切割。因其具有高效性、高特異性等特征，CRISPR/Cas9系統(tǒng)自2012年被應(yīng)用于細(xì)菌以后，便迅速發(fā)展并被用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因編輯。

目前，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在基因等基礎(chǔ)研究領(lǐng)域顯示出強(qiáng)大功能。在過(guò)敏、血液疾病及腫瘤等多種疾病治療的細(xì)胞藥物開(kāi)發(fā)中，CRISPR/Cas9也被廣泛應(yīng)用，并取得了顯著成效。此外，2014年開(kāi)始興起的CRISPR Screening具有強(qiáng)大篩選作用，通過(guò)sgRNA文庫(kù)的大批量構(gòu)建，已篩選出諸如細(xì)胞焦亡等多種生物學(xué)過(guò)程中的關(guān)鍵分子，也發(fā)現(xiàn)了肝細(xì)胞癌和免疫缺陷疾病等多種疾病的治療靶點(diǎn)?？傊珻RISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在生物醫(yī)藥各領(lǐng)域具有極其廣闊的應(yīng)用前景，推動(dòng)了該領(lǐng)域的快速發(fā)展。

二、CRISPR/Cas9在干細(xì)胞治療中的應(yīng)用

在干細(xì)胞治療領(lǐng)域，某些疾病僅靠單純的細(xì)胞替代并不能取得滿意效果。利用逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒將外源目的基因整合到干細(xì)胞基因組，僅對(duì)基因功能缺失的遺傳病具有良好療效，但也存在一定致瘤風(fēng)險(xiǎn)。相比之下，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)能夠精確實(shí)現(xiàn)基因敲入、敲除及堿基修復(fù)。因此，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行基因改造，不僅能夠增加干細(xì)胞治療的疾病范圍，也能更大程度地保證治療的安全性。目前，CRISPR/Cas9在干細(xì)胞治療領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，同時(shí)更多由CRISPR/Cas9編輯的干細(xì)胞藥物正在開(kāi)發(fā)中。

HSC移植是治療先天性免疫缺陷和血液疾病的相對(duì)成熟方案。然而，合適配型的供體缺乏導(dǎo)致移植受到極大限制。因此，有必要對(duì)自體HSC進(jìn)行基因編輯以改善其功能，為相關(guān)疾病治療提供可靠有效的HSC來(lái)源。截至目前，已有多個(gè)臨床試驗(yàn)采用CRISPR/Cas9對(duì)HSC進(jìn)行基因編輯，進(jìn)而治療血液疾病或免疫系統(tǒng)疾病。如修復(fù)HSC的IL2RG基因，回輸給患者后可治療X型SCID；敲除CCR5基因可增強(qiáng)患者對(duì)HIV病毒的抵抗能力；修復(fù)PKLR基因可有效緩解丙酮酸激酶缺乏癥；敲除BCL11A基因可激活γ-珠蛋白表達(dá)，從而治療鐮狀細(xì)胞貧血和β-地中海貧血。同時(shí)，在誘導(dǎo)造血干細(xì)胞（induced hemopoietic stem cell，iHSC）中，對(duì)編碼β-珠蛋白的基因HBB進(jìn)行單堿基修復(fù)也增強(qiáng)了對(duì)鐮狀細(xì)胞貧血的治療效果。

相較于各成熟細(xì)胞，iPSC更易進(jìn)行基因修飾，且擁有強(qiáng)大的擴(kuò)增能力及多向分化能力。這些特性有利于開(kāi)發(fā)相對(duì)均一的通用現(xiàn)貨型細(xì)胞藥物。就藥物質(zhì)控和開(kāi)發(fā)成本而言，采用基因編輯的iPSC進(jìn)行細(xì)胞藥物開(kāi)發(fā)必將成為大勢(shì)所趨。Fate Therapeutics公司的細(xì)胞藥物FT819，是一種在iPSC的T細(xì)胞受體α基因座中插入CAR，進(jìn)而分化產(chǎn)生不受患者限制的通用CAR-T細(xì)胞，也是首個(gè)現(xiàn)貨型、iPSC來(lái)源的CAR-T藥物。已有研究發(fā)現(xiàn)，利用CRISPR/Cas9敲除HLA-A和HLA-B基因可增強(qiáng)iPSC的免疫相容性，大幅度降低免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)。敲除CISH基因可延長(zhǎng)體外iPSC分化至NK細(xì)胞的周期，同時(shí)能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷功能，提高抗腫瘤活性。

除了HSC和iPSC治療外，CRISPR/Cas9在其他干細(xì)胞治療中也有廣泛應(yīng)用。如采用CRISPR/Cas9敲除人表皮干細(xì)胞COL7A1基因的80號(hào)外顯子，可矯正隱性營(yíng)養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥。在心肌梗死大鼠模型中，同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）的B2M基因被下調(diào)后，免疫排斥反應(yīng)受到抑制，心臟修復(fù)功能增強(qiáng)，生存率顯著提高。

綜上所述，CRISPR/Cas9應(yīng)用于干細(xì)胞治療領(lǐng)域，不僅提高了治療效果，增加了可治療疾病范圍，在安全保障方面也顯示出積極作用。

三、干細(xì)胞治療的現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)

干細(xì)胞治療作為一種再生醫(yī)學(xué)技術(shù)，旨在用具有特定功能的細(xì)胞替代功能異常細(xì)胞，恢復(fù)相應(yīng)細(xì)胞功能，改善機(jī)體健康狀態(tài)。目前有多種干細(xì)胞用于臨床，其中，HSC移植已改善多種免疫系統(tǒng)和血液系統(tǒng)疾病的預(yù)后，如先天性免疫缺陷、多發(fā)性骨髓瘤、地中海貧血等。研究數(shù)據(jù)表明，異體HSC的植入可將r/rAML（IDH1/IDH2突變的急性髓系白血?。┗颊叩?年生存率提高至20%~35%。自2006年問(wèn)世以來(lái)，iPSC制備技術(shù)發(fā)展逐漸成熟，在細(xì)胞治療領(lǐng)域展現(xiàn)巨大潛力。全球多家公司及科研機(jī)構(gòu)加入了iPSC細(xì)胞藥物開(kāi)發(fā)大軍，發(fā)現(xiàn)其對(duì)帕金森綜合征、老年黃斑變性眼病、重度心力衰竭等多種疾病有良好效果。此外，MSC因具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，被用于治療免疫性疾病，如移植物抗宿主病等，取得了一定療效。目前，部分干細(xì)胞藥物已成功上市，如用于治療腺苷脫氨酶缺乏性重度聯(lián)合免疫缺陷?。ˋDA-SCID）的自體HSC藥物Strimvelis及用于治療阿爾茨海默病的自體MSC藥物AstroStem。

某些遺傳病一方面由于自體干細(xì)胞同樣存在相應(yīng)基因異常，直接輸入不能明顯改善癥狀。?功能正常的異體干細(xì)胞雖能改善癥狀，但配型成功概率很低，存在排斥風(fēng)險(xiǎn)。因此，對(duì)這類遺傳病單純輸入干細(xì)胞并不是有效方案，需要對(duì)自體或異體干細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)基因修飾，以恢復(fù)其功能或降低排斥風(fēng)險(xiǎn)。早期干細(xì)胞基因修飾主要利用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體插入外源目的基因，恢復(fù)細(xì)胞功能。但這兩種病毒在基因組內(nèi)的整合具有一定隨機(jī)性，特別是前者具有較高致癌率。因此，需要更安全的技術(shù)來(lái)完成干細(xì)胞的基因修飾。這種整合外源基因的干細(xì)胞通常是針對(duì)特定基因功能缺失的疾病，對(duì)功能獲得性基因突變所致的疾病，并不能起到治療作用。此外，一些基因表達(dá)需要控制在一定生理水平。病毒載體雖能提供正確的基因序列，但難以精確控制其表達(dá)，因而對(duì)相應(yīng)疾病也不能取得良好效果。基于此，干細(xì)胞治療領(lǐng)域需要更精確的基因改造技術(shù)，實(shí)現(xiàn)原位修復(fù)目的基因，進(jìn)而治療更多類型的疾病。

四、展望

第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9發(fā)展至今，已衍生出不同功能工具。如依賴非同源末端連接的基因敲除、依賴同源末端修復(fù)和模板序列的基因敲入或修復(fù)、利用突變dCas9與堿基編輯蛋白融合的單堿基突變修復(fù)、構(gòu)建sgRNA文庫(kù)篩選靶點(diǎn)等。在干細(xì)胞治療領(lǐng)域，CRISPR/Cas9無(wú)疑擁有廣闊前景。臨床試驗(yàn)表明，CRISPR/Cas9可恢復(fù)特定患者干細(xì)胞的基因功能，相應(yīng)自體干細(xì)胞治療成為可能。此外，CRISPR/Cas9還可敲入/敲除某些基因，增強(qiáng)干細(xì)胞功能及安全性，這些同樣能夠促進(jìn)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。雖然當(dāng)前CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因插入效率還有待提高，但基因敲除的效率能夠滿足臨床需求。整體水平上，使用CRISPR/Cas9編輯的干細(xì)胞在臨床試驗(yàn)中取得了明顯療效，預(yù)計(jì)未來(lái)的使用頻率會(huì)進(jìn)一步提升。

人體內(nèi)除HSC 等少數(shù)種類外，其余不易獲取。因此，長(zhǎng)期以來(lái)，干細(xì)胞治療僅限于少數(shù)疾病。隨著iPSC制備和相關(guān)應(yīng)用技術(shù)的發(fā)展，這一局限正在被打破。iPSC以易獲得性及多向分化潛能而具有十分可觀的臨床應(yīng)用前景。同時(shí)，iPSC易進(jìn)行基因編輯，可通過(guò)該技術(shù)使下游分化的細(xì)胞獲得不同功能特性，以滿足多種疾病治療需求。可以預(yù)測(cè)，iPSC與CRISPR/Cas9的結(jié)合，將會(huì)給醫(yī)療行業(yè)帶來(lái)巨大變化。

（ID ：yxckbsc2022050501）

作者簡(jiǎn)介

包孟梅?

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南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士，曾于美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校訪學(xué)，現(xiàn)任西南地區(qū)首家iPSC綜合研究與應(yīng)用平臺(tái)——成都云測(cè)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)有限公司研發(fā)部基因編輯研究員，主要從事人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的基因編輯研發(fā)工作。曾參與“CRISPR/Cas13在擬南芥中的RNA編輯研究”“CRISPR/Cas9改造感受態(tài)菌株基因組”等CRISPR/Cas系統(tǒng)相關(guān)項(xiàng)目，發(fā)表SCI論文1篇，擁有豐富的CRISPR/Cas9基因編輯經(jīng)驗(yàn)。

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