中風是世界范圍內(nèi)殘疾和死亡的主要原因。

我們既往報告過一些關(guān)于干細胞治療中風的臨床研究和案例，應該說干細胞治療腦中風成功的希望還是很大，筆者身邊接觸的成功案例也不少，不過要想惠及所有人還有待時日。

本公眾號后臺有很多讀者迫切想了解相關(guān)進展，因此我們一直很關(guān)注這部分的進展。

從科學的角度，因為腦和中風病理學的異質(zhì)性，干細胞中風治療的臨床轉(zhuǎn)化依然有很多難題需要解決方案，瑞士蘇黎世大學的研究人員從他們的角度出發(fā)，提出了5個局限以及解決方案，雖然筆者不認同其中部分觀點，但部分內(nèi)容還是可供我們國內(nèi)讀者參考，特整理如下（如下圖文）。

? 推進中風細胞療法的五項原則

第一個原則:細胞來源

多種細胞來源都被認為可以成功地完成腦再生的細胞治療，包括成體干細胞、胚胎干細胞或誘導多能干細胞(iPSCs）（張等人2020)。然而，所有細胞類型都顯示出其適用性的局限性。

胚胎干細胞的優(yōu)勢在于可以無限增殖，但因為來自胚胎，所以它們受到嚴重的倫理關(guān)注，并且它們具有腫瘤形成風險。

隨著iPSCs的引入，倫理問題被克服。iPSCs是通過各種重編程因子的異位表達將體細胞重編程為多能胚胎干細胞樣狀態(tài)而產(chǎn)生的(德·勒烏和塔克伯格2019)。雖然最初的方法使用整合慢病毒，但最近的發(fā)展可以通過游離載體或仙臺病毒進行非整合重編程，這進一步降低了惡性細胞變異的風險，為iPSCs的臨床應用鋪平了道路(Hockemeyer和Jaenisch，2016年)。由于細胞培養(yǎng)物中的iPSCs可以無限擴增并主要分化成每一種體細胞類型，它們代表了用于治療目的所需的任何類型人類細胞的無限資源。移植前，iPSCs通常分化為所需的神經(jīng)細胞類型，因為具有復雜樹突的成熟神經(jīng)元，利用其易接近性和易隔離性，以促進腦再生。

由間充質(zhì)細胞組成的干細胞可能發(fā)揮營養(yǎng)支持作用和免疫調(diào)控，但不會分化成神經(jīng)譜系，因此，它們不是細胞替代療法而是營養(yǎng)療法(Laso-García等人2019)。

原代神經(jīng)干細胞可以整合到受損的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，但很難獲得，因為它們通常是從接受神經(jīng)外科手術(shù)治療癲癇的個體的顳葉或腦室下區(qū)提取的。或者可以來源于流產(chǎn)的胎兒組織，并在永生化后克隆擴增(Kalladka等人2016)。

胚胎干細胞具有更強的分化成多種細胞類型的能力不適合細胞移植，優(yōu)選使用神經(jīng)前體細胞。神經(jīng)前體細胞可以根據(jù)所需的前體和疾病病理進一步定制。例如，iPSC衍生的多巴胺能祖細胞在帕金森病的靈長類動物模型中顯示出有希望的結(jié)果，該模型涉及黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的變性(Kikuchi等人2017)。在中風中，丟失了更異質(zhì)的神經(jīng)細胞群；因此，來自較低分化階段的神經(jīng)元前體細胞有望獲得更好的結(jié)果，并在臨床前模型中更頻繁地使用(Kokaia等人，2018)。

iPSC衍生細胞的移植也與腫瘤形成的風險相關(guān)(Yamanaka 2020)。然而，仔細的質(zhì)量控制和有效的分化方案結(jié)合新的遺傳安全開關(guān)技術(shù)(見第五個原則)可以大大降低iPSC衍生細胞的致瘤潛力。因此，我們認為基于iPSCs的細胞治療是實現(xiàn)損傷或疾病后功能性腦再生的最有前途的方法，然而還需要一定時間的臨床安全驗證。

第二個原則:給藥途徑

如果移植物不能到達受影響的腦組織，那么產(chǎn)生最適合腦再生的細胞源就沒有什么意義。

盡管目前的臨床前細胞治療研究支持局部移植大腦(Kokaia等人，2018年)，超過一半的臨床試驗傾向于通過全身血液注射來施用細胞(Negoro等人，2019年)。

該領(lǐng)域面臨著一個困境：局部實質(zhì)內(nèi)細胞移植有望獲得最大療效，但注射的相關(guān)風險高，這阻礙了其廣泛應用。

全身注射是微創(chuàng)的，然而大多數(shù)細胞最終進入非病變器官，因此只能起到預期有限的治療效果。

有趣的是，在不同類型的全身注射中也可以觀察到遞送的差異。人們普遍認為，在中風的嚙齒動物模型中，靜脈內(nèi)注射細胞導致1%的細胞到達大腦(陳等，2001)，而動脈內(nèi)注射可能產(chǎn)生1%至10%(羅德里格斯等，2016)。當然，這些百分比可能根據(jù)細胞類型、腦損傷的時間和嚴重程度以及相關(guān)的血腦屏障(BBB)損傷而變化。

近年來，已經(jīng)確定了幾種機制，證明內(nèi)源性外周免疫細胞(例如，中性粒細胞、淋巴細胞、樹突細胞)穿過完整和受損的BBB (Marchetti和Engelhardt 2020)。這一過程涉及血腦屏障內(nèi)膜的變化，以增加粘附分子的表達，減少緊密連接蛋白的存在。同時，它需要進入細胞的相應表面肽的表達來介導穿過BBB的滾動、粘附和滲出(Marchetti和Engelhardt 2020)。例如，SDF-1a/CXCR4軸線是穿越BBB的最重要的遷徙路線之一(Man等人，2012: 1)。在某種程度上，這些路徑也被確定為將移植物導向受損大腦和脊髓的損傷部位(陳等，2015；希爾等人2004: 1)。因此，這些蛋白在移植物中的基因過表達或藥理學誘導可能是一種有希望的方法，可以顯著改善移植物向損傷處的定向遷移。

在大腦中，同樣重要的是確保移植細胞在損傷部位的保留和植入。特別已知移植的干細胞具有高遷移率(在7天內(nèi)，從移植部位起高達1.8mm；陳等2015)認為，這可能會導致大腦內(nèi)出現(xiàn)不必要的滯留。對于局部移植，最有利的方法被證明是移植物的水凝膠包裹，這提高了保留和存活率，同時改善了移植物的成熟(Payne等人2019年)。然而，由于血管閉塞的風險，水凝膠包封對于全身應用的細胞難以實施。一種有希望的替代方法是通過細胞表面工程將移植物導向損傷特異性微環(huán)境。幾項研究已經(jīng)破譯了動物模型中中風組織的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組反應(Androvic等人2020；鄭等人2020)。遵循癌癥嵌合抗原受體T細胞療法的原則(Rafiq和other 2020)，結(jié)合中風相關(guān)肽可增強損傷部位移植物的歸巢，并在系統(tǒng)應用后提供更有針對性和更有效的細胞療法。這些方法目前也在其他急性損傷中進行了測試。例如，CD45陽性的骨髓干細胞與結(jié)合CD45和肌球蛋白輕鏈(存在于受損心肌細胞中)的磁性雙功能抗體共同應用，顯示心肌梗死后移植物保留率提高(Cheng等，2014)。

我們認為，未來的細胞腦內(nèi)轉(zhuǎn)運應該是全身性的，可能依賴于細胞對損傷環(huán)境的遺傳或藥理學功能化，以提高在靶區(qū)的歸巢和滯留，同時確保注射過程中的低風險。然而，最佳靶點仍有待闡明和臨床前驗證。

此外，損傷環(huán)境是高度可變的，并且在腦損傷的急性和慢性階段可以有很大的不同，所以在急性期和慢性期是否選擇同樣的輸注途徑有必要繼續(xù)探討。

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第三個原則:移植的時機

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卒中后的標準臨床程序是通過重組組織纖溶酶原激活劑溶栓或機械性血管內(nèi)血栓清除術(shù)。盡管這些方法非常有效，但它們僅適用于少數(shù)中風病例，并且不是所有患者都獲得了積極的結(jié)果。據(jù)估計，不到30%的中風患者在要求的狹窄治療時間窗內(nèi)到達，其中只有50%的患者適合急性臨床治療(方等，2010)。緊急治療后，患者通常在醫(yī)院停留至少24h，直到病情穩(wěn)定，然后開始康復訓練(AVERT試驗協(xié)作組2015)。中風的腦組織在急性期形成一個不利的環(huán)境，具有高水平的炎癥、氧化應激、細胞死亡和碎片，這降低了移植物的存活機會(施等人2019)。

因此，未來細胞治療的最佳治療窗口估計是從中風后幾天到1周開始，以確保移植物的長期存活。因此，大多數(shù)臨床前研究和一些臨床設(shè)計在中風后的亞急性期進行移植物移植(Kelly等人2004；Kokaia等2018；Rust等2022)。這一階段對于全身細胞注射特別有意義，因為中風可導致雙向BBB開放，在中風后4至6小時和3天可傳遞性增加；這個時間窗口增加了更有效的移植物滲透到受傷部位(康和姚2020；韋伯等人2020)。

由于全球有超過1億人患有中風，并且每二到三名患者中就有一名患有永久性缺陷(GBD 2016)，考慮對慢性中風患者(此處定義為事件發(fā)生后6個月以上)進行細胞療法也是很重要的。很少有臨床前研究在嚙齒動物模型中研究細胞在慢性中風的有益作用，部分結(jié)果是積極的(Bhasin等人2016；史密斯等人2012；Yasuhara等人，2009年)。一個原因是用傳統(tǒng)的行為測試檢測中風嚙齒動物的長期缺陷的挑戰(zhàn)。然而，每兩個臨床試驗就有一個針對的是慢性中風患者，這可能也是由于臨床緊迫性和患者可及性(Negoro等人2019年)。

在急性卒中向慢性卒中的轉(zhuǎn)變中，損傷后6個月至1年，通常大部分受影響的神經(jīng)組織和皮質(zhì)脊髓束喪失；神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕是由于血液供應異常而形成的；許多受損患者在恢復期經(jīng)歷平臺期(韋克斯勒等人，2018年)。

雖然細胞因子的釋放已被證明有助于改善急性中風后的功能恢復(Llorente等2021；王等2016)，慢性卒中后細胞治療的作用機制尚不明確。在組織喪失和重塑的這一階段，通過細胞替代來增強功能恢復是干細胞不可能完成的。然而，神經(jīng)和非神經(jīng)干細胞移植已被證明能夠啟動血管生成，改變微環(huán)境，增強突觸活性，并促進剩余腦宿主組織中的內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生(Kokaia等人2018)。所有這些觀察都是基于這樣的假設(shè)，即移植物分泌促進再生和可塑性的因子，從而改善整體功能恢復。在這些因素中，血管內(nèi)皮生長因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)生長因子的釋放已被確定為臨床前和臨床研究中的重要旁分泌機制(Bacigaluppi等人2016；Bhasin等人2016)。

這些研究的一個要點是，在中風后的急性期和亞急性期，干細胞治療通過直接替代和營養(yǎng)因子有助于功能恢復。

在慢性期，細胞療法的營養(yǎng)支持作用更可能是促進恢復的主要機制。

第四個原則:免疫相容性

免疫排斥是細胞治療中的另一個關(guān)鍵問題。

自體iPSC療法(即應用患者自身體細胞產(chǎn)生的iPSC)可能是解決這一問題的最合適的選擇(Yamanaka 2020)。事實上，首次將自體iPSC衍生的視網(wǎng)膜細胞應用于患有黃斑變性的患者的研究沒有顯示任何移植排斥的跡象(Mandai等人2017)。然而，符合良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)的單個iPSC細胞系的生產(chǎn)及其質(zhì)量和安全控制的高投入和巨大成本(估計每細胞系80萬美元(Rehakova等人，2020年))目前不允許對一系列患者進行自體療法。此外，由于臨床產(chǎn)生個體自身的iPSCs需要時間，自體方法不適用于急性疾病。

同種異體移植物是來自同一物種不同個體的細胞或組織。這種方法提供了現(xiàn)成的潛力，并且已經(jīng)建立了用于存儲臨床級細胞系的細胞庫(Umekage等人2019)。京都大學目前正在進行一項使用同種異體iPSC衍生的多巴胺能前體細胞治療帕金森病的臨床試驗(Takahashi 2020)。然而，這種方法需要使用免疫抑制劑進行長期治療，這可能會產(chǎn)生嚴重的副作用，如移植后糖尿病、高脂血癥、神經(jīng)毒性或急性和慢性神經(jīng)毒性(Wojciechowski和Wiseman 2021)。與器官移植不同，免疫抑制藥物的治療可能不是細胞療法的終身療法。

減少同種異體移植排斥反應的一種方法是人類白細胞抗原(HLA)配型。

另一種方式是創(chuàng)建具有最高免疫相容性的iPSCs，對其HLA基因進行靶向遺傳修飾，產(chǎn)生所謂的通用細胞。雖然完全的HLA敲除可以保護移植物免受T細胞介導的免疫反應，但它會使移植物受到NK細胞的破壞(Trounson等人2019)，然而，HLA敲除細胞也可以通過CD47的慢病毒過表達逃避NK細胞的監(jiān)視，從而產(chǎn)生低免疫原性細胞(Deuse等2019)。另一種避免轉(zhuǎn)基因表達的方法是在HLA-A和HLA-B敲除的iPSCs中保留單個HLA-C等位基因(徐等，2019)。HLA-C保留的iPSCs可以在體內(nèi)外逃避T細胞和NK細胞的反應。據(jù)估計，12個HLA-C保留的iPSC系與超過90%的世界人口相容。

然而，免疫豁免細胞的產(chǎn)生會增加了不必要的惡性轉(zhuǎn)化或病毒感染的風險，因為它們可能不會被免疫系統(tǒng)檢測到(González等人，2020年)。因此，有必要開發(fā)將這種風險降至最低的工具，例如通過自殺基因的遺傳工程。

第五個原則:風險最小化

基于細胞的再生療法并非沒有風險，移植前后的安全措施至關(guān)重要。

風險范圍包括急性腦出血(在立體定向局部注射時)、細胞聚集或細胞誘導的栓塞(對于全身注射)以及功能性副作用(如癲癇發(fā)作和不自主運動)。

從長遠來看，最大的問題是移植細胞形成惡性腫瘤，以及移植細胞沉積在不需要的組織中。

為了將這些風險降至最低，iPSC衍生的細胞必須經(jīng)過各種質(zhì)量控制實驗。這已經(jīng)從在GMP條件下生產(chǎn)和擴大臨床級細胞開始，其要求包括在潔凈室設(shè)施中工作和所有生產(chǎn)步驟的詳細記錄，以及使用經(jīng)認證和符合GMP要求的無菌培養(yǎng)基、物質(zhì)和設(shè)備(Gee 2018Rust等2022)。

臨床級iPSCs的質(zhì)量控制包括對細胞身份、基因組穩(wěn)定性、多能性基因和標記表達、細胞形態(tài)和活力以及微生物無菌性的詳細分析(Sullivan等人，2018年)。然而，如果由于iPSCs的不完全分化而使?jié)撛诘闹铝鰅PSCs留在移植物中，那么最好的質(zhì)量控制也是無用的。

因此，已開發(fā)了純化分化細胞和/或去除殘留iPSCs的技術(shù)(Fujita等人2022；勝川等人2016)。基于熒光激活細胞分選或磁激活細胞分選的符合GMP的細胞分選方法的發(fā)展使得iPSC衍生細胞的純化可用于臨床應用。事實上，在目前對帕金森病患者的一項試驗中，施用的多巴胺能前體細胞通過具有熒光激活細胞分選的抗CORIN抗體而富集(Kikuchi等人2017)。另一種方法代表“RNA開關(guān)”，一種包含特定miRNA結(jié)合域的合成mRNA(Fujita等人2022)。根據(jù)mRNA開關(guān)的設(shè)計，miRNA的結(jié)合可以打開(mRNA被翻譯)或關(guān)閉(mRNA不被翻譯)。通過靶向細胞類型特異性miR-NAs-例如在iPSCs中高度表達的miR-302 a-5p-并通過使用編碼barnase(一種導致細胞死亡的核糖核酸酶)的RNA開關(guān)，可以實現(xiàn)從培養(yǎng)物中選擇性去除殘余iPSCs。然而，即使是不含殘留iPSCs的移植物也可能含有殘留的分裂神經(jīng)干細胞或祖細胞，這可能令人擔憂，并具有移植物過度生長的風險。

此外，如原則2所述，全身應用的細胞可能最終出現(xiàn)在非期望的組織中。因此，移植后安全工具的建立是iPSC治療的重中之重。

安全開關(guān)系統(tǒng)的發(fā)展使移植細胞在發(fā)生不良事件時能夠特異性消融。在前藥介導的方法中，用編碼將無活性前藥轉(zhuǎn)化為毒性化合物的酶的基因轉(zhuǎn)導移植細胞(Sheikh等人2021)。最常用的組合是單純皰疹病毒胸苷激酶的表達和前體藥物ganci- clovir的治療，該藥物已被證明在輸注自殺基因工程供體淋巴細胞后可消除白血病患者的移植物抗宿主病(Ciceri等，2009)。另一個方法是在移植細胞上應用單克隆抗體，利用其補體激活或抗體依賴性細胞毒性消除移植細胞。移植到小鼠體內(nèi)后，用抗截短的人上皮生長因子受體的抗體治療成功消除了嵌合抗原受體T細胞(Paszkiewicz等人2016)。第三種方法是在細胞移植物中表達iCasp9(誘導型胱天蛋白酶9)，用生物學惰性物質(zhì)AP1903處理誘導iCasp9的二聚化，導致通過凋亡去除移植物。

所有這些安全開關(guān)都有一個明顯的限制，因為相應的藥物或抗體的血腦屏障都是固定的。然而，特別是對于iPSC衍生細胞用于腦再生的應用，重要的是具有靈活可用的系統(tǒng)。在全身注射的情況下，并且為了去除在外周富集并且沒有進入大腦的細胞，前藥/抗體不應該穿過BBB。然而，如果大腦中的移植物顯示惡性轉(zhuǎn)化，則需要可透過血腦屏障的前藥/抗體。因此，我們建議產(chǎn)生一種安全開關(guān)，其中前體藥物以兩種修飾形式存在:BBB通透型和非通透型。

結(jié)論

總之，我們認為，在可預見的未來，中風的細胞療法具有增加患者治療選擇的巨大潛力。

全身和急性期注射最有希望成為適用于一系列中風患者的有效細胞療法。

目前正在開發(fā)遺傳和藥理學工具，以確保精確靶向大腦受傷區(qū)域。作者認為，使用與大多數(shù)人群相容的“通用”iPSC來源的神經(jīng)細胞系比個體化患者來源的細胞移植物更具可行性。通用細胞系不僅可以克服后勤和成本方面的障礙，還可以配備新型的基因安全開關(guān)，大大提高其安全性，并最大限度地降低癌變的風險。