iPSC細胞療法在日本的臨床研究

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角膜之所以維持透明，它表面的上皮細胞功不可沒。我們人類的角膜上皮細胞不斷生長，不斷更新，而維持這種更新的源泉就是角膜緣干細胞。當角膜緣干細胞缺乏時（即角膜緣干細胞缺乏癥，limbal stem cell deficiency，LSCD），會導致角膜上皮持續性缺損，角膜血管化、角膜潰瘍感染、不透明，嚴重者造成角膜穿孔、甚至危及整個眼球，導致失明。供體角膜移植已被用于治療可能導致失明的嚴重角膜上皮疾病，但也存在排斥反應和供體短缺的問題。

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日本大阪大學的眼科醫師 Koji Nishida（西田幸二）團隊利用iPSC來源的角膜細胞組織層來修復損傷的角膜。研究小組開發了一種二維培養系統“SEAM方法”，通過促進iPS細胞自分化來組織重建所有的眼樣結構。這個細胞薄片構成眼睛的主要細胞群（包含角膜上皮、視網膜和晶狀體上皮）出現在組織的特定區域。研究小組從二維組織結構中分離出了角膜上皮祖細胞，并成功地產生了功能性的角膜上皮組織。

?iPSC治療角膜緣缺乏癥示意圖?

研究小組通過將人類iPSC制備的角膜上皮組織移植到動物模型中，證明了治療效果。在2019年7月至2020年12月，這個研究小組把用iPSC制作的厚度0.05毫米薄膜狀角膜組織，移植給幾乎喪失視力的“角膜緣干細胞缺乏癥”的4名患者的全球首例臨床研究已完成。

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此后經過1年的隨訪觀察，未發生排異反應和癌變等問題，確認了安全性。全部患者癥狀均有改善，其中3人的矯正視力提高，有患者從0.15升至0.7。

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大多數哺乳動物，大腦在胚胎時期就已經完成大部分，只有一小部分神經在出生后持續發展。神經損傷引起的疾病將導致永久性的殘疾，如何利用iPSC來修復神經系統是目前干細胞療法的熱門研究。

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人們發現利用iPSC分化的多巴胺能神經元可以治療帕金森病。帕金森病是大腦黑質區（subatantia nigra）分泌多巴胺的神經細胞退化造成的一種疾病。帕金森病僅次于阿爾茨海默病，是第二常見的神經退行性疾病。在美國，男性的終生風險為2%，女性為1.3%。

日本京都大學iPS細胞研究所JunTakahashi（高橋淳，也就是高橋政黛的丈夫）研究小組于2018年8月開展使用iPSC來源的多巴胺神經祖細胞治療帕金森病的臨床試驗。臨床試驗移植的細胞來自HLA-homo iPS 細胞庫。種子細胞iPSC經過誘導分化，并通過流式細胞儀分選純化出corin陽性的細胞（corin是多巴胺神經祖細胞的細胞表面標記物）。研究小組將與HLA匹配后的異體iPSC誘導分化為多巴胺神經祖細胞，配合低量免疫抑制劑，通過定位腦手術將大約500萬個分化的細胞移植到患者大腦紋狀體左右兩側皮質部分。

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在臨床試驗之前，先證實了移植的人類iPSC來源的多巴胺神經祖細胞在帕金森病的食蟹猴模型中的有效性和安全性。經過兩年的跟蹤，沒有觀察到猴子腫瘤的形成，也沒有發現任何惡性轉化的證據，確認了安全性。結果顯示：移植的猴子運動活動增加，帕金森病癥狀有所改善。PET分析顯示，移植的細胞在大腦中合成了多巴胺。

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脊髓損傷（Spinal cord injury），通常指脊髓受到外部影響，造成損傷部位及其以下部分癱瘓或全部癱瘓，使患者終身殘疾。脊髓損傷是一種比較常見的外傷。脊髓損傷治療的難點在于神經傳導重建及運動功能的恢復。

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日本慶應大學生理學?Hideyuki Okano（岡野榮之）研究小組于2019年2月被批準開展使用采用iPSC來源神經祖細胞治療亞急性期脊髓損傷的臨床研究。但由于COVID-19疫情原因，研究被延后至2021年年底才得以開展。臨床試驗移植的細胞來自HLA-homo iPS細胞庫。臨床試驗選擇的適應癥，為亞急性脊髓損傷（C3/4-Th10水平，損傷后14-28天內），共納入4名受試患者。試驗的主要目的是評估hiPSC-NS/PC移植細胞和移植方法的安全性。次要目標是獲得其對神經功能和生活質量影響的初步證據。

iPSC治療脊髓損傷的臨床概要

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心力衰竭（heart failure）簡稱心衰，是由于心臟泵血力量不足導致的一種心臟疾病。缺血性心臟病是由于冠狀動脈阻塞引起心肌組織慢性缺血，從而導致功能性心肌細胞壞死。然而，成熟的心肌細胞是不能自我更新的，缺血和壞死區域的心肌逐漸被纖維組織所取代。因此，補充功能性心肌細胞是延緩心衰進程的一種合理方法。因為心肌細胞沒有增殖能力，難以大量產生。因此，骨骼肌細胞、骨髓單個核細胞和間充質干細胞（MSCs）都是候選細胞，被用于替代心肌細胞，并進行了動物實驗和臨床試驗。

起初，細胞片由自體骨骼肌細胞制造的，可以直接貼到心臟表面。治療機制主要依靠細胞片旁分泌的營養因子和細胞片細胞與宿主心肌融合。然而，因為是自體個性化移植，缺點很明顯：一是患者需要等待時間長，二是制作成本較高。因此，開發一種通用型標準化現貨性產品，尤為重要。細胞薄片，便是這樣一種產品，通過HLA配型后的iPSC衍生的心肌細胞薄片，可當做通用型產品。

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在動物實驗中，研究發現人類胚胎干細胞衍生的心肌細胞在組織學上和電生理學上都能與宿主心肌匹配結合，這與以前移植的非心肌細胞不同。在猴子實驗，也顯示了其生存能力和功能的改善。在猴子心肌梗死模型中，HLA匹配的猴子iPSC來源的心肌細胞即使在移植后12周仍能存活，并產生宿主心臟的功能改善。然而，在所有的猴子中都觀察到一些室性心律失常，這表明處理移植前的心律失常的影響是必要的。

在日本，HEARTSHEET??的發明者之一，大阪大學的外科醫生?Yoshiki Sawa教授通過 iPSC制成心肌細胞薄片，用于治療豬的心力衰竭。研究小組研究了心臟功能改善的機制，包括分析了iPSC來源的心肌細胞的旁分泌因子。研究小組通過HLA-homo iPS 細胞成功制備了大量高度安全的心肌細胞薄片，可以用于人體移植。目前，研究小組正在進行一項臨床試驗，以驗證心肌細胞薄片治療心力衰竭的安全性和有效性（jRCT2053190081）。臨床適應癥是缺血性心臟病，招募10個病人。

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在日本，每年臨床需要超過170萬升血小板，主要獻血者捐贈。尷尬的是，血小板在采血后只能保存4天。由于新生兒出生率下降和人口老齡化，獻血者群體的數量正在減少，但需要血小板的老年人群體數量正在增加。未來，不僅是血小板制劑，而且輸血制劑也可能出現供應不足的情況。

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通常，再生障礙性貧血（即“再障”）或其他疾病造成的嚴重血小板減少，需要進行血小板輸血。然而，輸血可能會引起血小板輸血頑固可能發生，即輸血后血液中的血小板不會升高。其主要原因是外來的血小板被患者自身免疫細胞破壞。在這種情況下，血小板不能通過異基因血小板輸血來補充。如果血小板是由自體細胞制造的，輸血就不會發生免疫反應。

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日本京都大學iPS細胞研究所（CiRA）教授 Koji ?Eto，利用生物反應器從iPSC中制造出大量血小板，并開展再生障礙性貧血合并血小板輸血頑固性的臨床研究。臨床試驗目的是檢測血小板制劑的安全性。單劑量遞增研究，輸血后隨訪一年。血小板治療的過程：采集患者細胞，制備成iPS細胞。接著，再把iPS細胞制備成造血祖細胞，再分化成巨核細胞，并冷凍作為主細胞庫，巨核細胞可以長時間儲存。最后，由巨核細胞制備血小板。需要注意的是，血小板分離、濃縮和清洗后，需要通過照射根除殘留的巨核細胞。

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近年來，癌癥免疫治療作為手術治療、化療（抗癌藥物和激素給藥）和放療后的重要治療選擇，越來越到關注。

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NKT細胞（自然殺傷T細胞）是一類兼具NK細胞和T細胞部分表型和功能的細胞亞群，通過識別CD1d上的MHC-I激活。被激活的NKT細胞，通過產生穿孔素等表現出直接的細胞毒活性。同時，也產生大量的細胞因子（如IFN-γ），誘導激活NK細胞和CD8+ T細胞，發揮抗腫瘤作用。

作為一種治療頭頸癌的新療法，Haruhiko Koseki 和 Shin-Ichiro Fujii 研究組正在進行一項使用iPSC衍生的NKT細胞的臨床試驗（jRCT2033200116）。iPSC衍生的NKT細胞治療的過程：首先，將異體iPSC誘導成NKT細胞，進行擴增培養，然后將約 3X10*8 個制備的NKT細胞，注入已接受現有患者的腫瘤部位血管內。根據輸入后不良反應等情況及時調整劑量，共計回輸3次。隨訪2年，確認安全性和有效性。

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骨關節炎是世界上最常見的關節疾病，在60歲以上人群中，10%的男性和18%的女性都受其影響。

日本京都大學iPS細胞研究所（CiRA）Noriyuki Tsumaki教授開展使用iPSC來源的軟骨移植治療關節軟骨損傷的臨床試驗（jRCTa050190104）。研究團隊已成功制備出了iPSC來源的高質量軟骨。先前動物研究證實，iPSC來源的軟骨不會產生腫瘤，并在移植區可以再生軟骨。

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臨床研究目的是評價軟骨損傷患者實施細胞移植后的安全性。主要終點事件是不良事件發生的頻率和是否腫瘤發生。為了制備軟骨，軟骨細胞從來自HLA-homo iPS 細胞庫里的iPSC誘導，軟骨組織由軟骨細胞產生。研究人員的目標是在未來用這種療法來治療膝關節骨性關節炎。

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在臨床研究中，研究者對患者實施單側膝關節腔細胞移植，參與臨床試驗的患者4例，年齡在20-70歲，軟骨部分損傷。關節鏡下實施細胞移植修復軟骨缺損。患者術后恢復6周。隨訪1年，觀察軟骨再生和修復情況。

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尿素循環障礙是指當尿素循環中某一種酶有先天性缺陷時，氨合成尿素發生障礙，游離的氨蓄積體內，形成高氨血癥，臨床上表現為嚴重的腦功能障礙。這個過程發生在肝臟細胞中。

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傳統的治療手段需要進行肝臟移植，但出于安全考慮，日本規定只有在患兒體重達到6kg（一般出生3~5月以上）后才能進行移植。為了給后續的肝移植打下基礎，需要在肝移植之前需要進行“橋梁治療”。在日本，由于沒有來自捐贈肝移植供體的肝細胞，最大挑戰是確保質量一致的肝細胞作為肝細胞移植的穩定供應來源。

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日本國立成育醫療研究中心 Akihiro??Umezawa?研究小組專注于制備人胚胎干細胞來源的肝細胞（JMA-IIA00412），建立了人類胚胎干細胞來源的肝細胞庫，長期低溫保存，能夠適應緊急使用。

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臨床研究中，在一名患有“尿氨酸血癥1型”的尿素循環異常癥的患兒出生的第六天，研究小組分兩次在腹部注射了1.9X10*8個胚胎干細胞誘導分化來的肝細胞，用以提高肝臟的解毒功能。給藥完成后，沒有任何與移植過程相關的并發癥或不良事件。患兒進行胚胎干細胞治療后，大概6個月左右就接受了來自父親的活體肝移植。同時，醫院給患兒使用免疫抑制劑，避免了患兒產生排異反應。術后第二個月，患兒就出院了。患兒的移植很成功，病情穩定。這是日本國內首次使用胚胎干細胞治療人體疾病，也是世界首例使用胚胎干細胞誘導肝細胞的移植手術。

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慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）是指各種腎臟疾病引起的緩慢進行性腎功能損害，最后導致尿毒癥和腎功能完全喪失。由于捐獻的腎源有限，絕大部分腎功能衰竭患者都只能依賴透析。在日本，大約有33萬名透析患者，其中約有7000人已經接受透析治療超過30年。

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腎移植是一種恢復腎功能的治療方法，是終末期腎衰竭患者透析的替代方法。腎臟移植主要有尸體腎移植和活體供腎移植。在日本，來自捐贈者的腎移植比較少。日本每年進行腎移植的數量被限制在約1700例左右。比起美國每年進行的2萬多例，相差甚遠。因此，治療腎臟疾病的再生醫學正在被熱切地期待之中。

?種間腎臟再生技術圖示

研究小組將的iPSC誘導分化為腎元祖細胞 (nephron progenitor cells, NPCs)，體外培育成腎芽后再移植給正在接受人工透析治療的腎衰竭患者。先使用來自HLA-homo iPS 細胞庫的腎元祖細胞，培育成腎芽，再分化誘導刺激形成腎小球和腎小管。由于腎臟被一層薄薄的膠囊覆蓋，在動物實驗中，研究團隊將iPSC來源的NPCs注入腎實質和囊之間的空間，對缺血再灌注損傷誘導的急性腎衰竭小鼠模型有治療作用。

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我們概述了日本使用基于iPSC進行的臨床試驗。雖然iPSC仍然面臨諸多挑戰，但仍不能阻擋其在細胞治療和其他應用方面的巨大潛力。大量的科學家仍然持續在這一領域進行努力耕耘，不斷克服剩余的障礙。

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近年來，國內基于iPSC治療的企業也如雨后春筍般興起，紛紛申請開展IND或IIT，開始各種嘗試，探索中國的iPSC治療。在不久的將來，基于iPSC的細胞治療技術將成為一項真正的臨床選擇，在全球范圍內為病人帶來福音。

參考資料：