CAR-NK特定的CAR結(jié)構(gòu)

在NK細(xì)胞中實施CAR技術(shù)通常使用優(yōu)化用于誘導(dǎo) T 細(xì)胞活化的構(gòu)建體。盡管T細(xì)胞和 NK細(xì)胞之間的一些信號傳導(dǎo)是保守的，即CD3ζ和4-1BB，但 CAR-T 細(xì)胞中常用的其他共刺激結(jié)構(gòu)域以及TM結(jié)構(gòu)域和鉸鏈在NK細(xì)胞中完全不存在，即CD8α和CD28。此外，導(dǎo)致免疫突觸形成和靶細(xì)胞隨后細(xì)胞溶解的激活信號的差異是細(xì)胞類型特異性的。由于最有效的NK細(xì)胞亞群，即所謂的“連環(huán)殺手”，仍然無法從表型上識別出來，這使情況變得更加復(fù)雜。

NK細(xì)胞上的激活受體利用多種銜接分子進(jìn)行下游信號傳導(dǎo)，包括 CD3ζ、DAP10、DAP12 和 FcRγ 鏈。雖然CD3ζ包含并通過3個基于免疫受體酪氨酸的激活基序 (ITAM) 域發(fā)出信號，但 DAP10、DAP12和FcRγ鏈各只包含一個ITAM域。

通過CD3ζ傳遞信號的NK細(xì)胞受體包括CD16、NKp30 和 NKp46，其中CD16和NKp46也通過FcRγ 鏈傳遞信號。

與DAP12相比，DAP10參與通過NKG2D介導(dǎo)信號傳導(dǎo)DAP12充當(dāng)激活KIR、NKG2C和NKp44的銜接蛋白。

NK 特異性CAR構(gòu)建體主要集中在將DAP10或DAP12作為激活域或作為與CD3ζ一起的共刺激域合并。DAP10的整合是成功的，但只能與NKG2D結(jié)合，符合內(nèi)源性NKG2D信號。

第二代CAR構(gòu)建體以NGK2D作為胞外域，DAP10和CD3ζ構(gòu)成胞內(nèi)域，在使用骨肉瘤異種移植小鼠模型進(jìn)行體外和體內(nèi)測試的原代NK細(xì)胞中表現(xiàn)出增加的表面表達(dá)和功能。

然而，另一種利用與4-1BB和DAP10融合的NKG2D TM結(jié)構(gòu)域的針對PD-1的CAR構(gòu)建體發(fā)現(xiàn)DAP10是多余的，缺乏DAP10的相同構(gòu)建體顯示出更好的NK細(xì)胞功能。這種抑制性CAR構(gòu)建體旨在使用抑制性PD-1信號激活NK細(xì)胞，僅利用NKG2D作為TM結(jié)構(gòu)域。

作為一種II型蛋白，與通常用于CAR構(gòu)建體的I型膜蛋白（即CD8α和CD28）相比，NKG2D 的跨膜區(qū)有所不同。使用 II 型蛋白質(zhì)作為 TM 結(jié)構(gòu)域的額外挑戰(zhàn)通過構(gòu)建體的不良表面表達(dá)而變得明顯。此外，確保構(gòu)建體中NKG2D和DAP10之間的相互作用似乎是通過DAP10 包含構(gòu)建體確定有效信號傳導(dǎo)的主要因素。

另一項比較包含DAP10或CD3ζ的靶向CD19的第一代CAR的研究證實了這一點，其中CD3ζ 作為激活域的表現(xiàn)優(yōu)于DAP10。

另一方面，在體外和體內(nèi)小鼠研究中，DAP12在轉(zhuǎn)導(dǎo)到原代NK細(xì)胞的第一代CAR中的表現(xiàn)優(yōu)于 CD3ζ，無論使用哪種scFv。

NK 特異性CAR構(gòu)建體的最大比較是在NK-92細(xì)胞中進(jìn)行的，包括對四個不同跨膜結(jié)構(gòu)域（CD16、NKp44、NKp46 和 NKG2D）和四個不同共刺激結(jié)構(gòu)域（2B4、DAP10、DAP12、和 CD137)與 CD3ζ 的各種組合。只有三個構(gòu)建體導(dǎo)致細(xì)胞溶解反應(yīng)增加，選擇包含 NKG2D TM 結(jié)構(gòu)域和2B4共刺激結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體在iNK細(xì)胞中進(jìn)行進(jìn)一步分析。

NK-92細(xì)胞中作為共刺激結(jié)構(gòu)域的2B4與4-1BB的另一個比較有利于含有2B4的CAR構(gòu)建體，其誘導(dǎo)快速增殖，增加細(xì)胞因子產(chǎn)生和脫顆粒，并減少轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。2B4是信號淋巴細(xì)胞激活分子(SLAM)家族受體的成員，并結(jié)合CD48，通常由造血細(xì)胞表達(dá)。它通過其基于免疫受體酪氨酸的開關(guān)基序(ITSM)發(fā)出信號，該基序在磷酸化后募集接頭蛋白，例如SAP和EAT-2。

為了解決通常與注入的NK細(xì)胞相關(guān)的體內(nèi)持續(xù)時間短的問題，Liu等人改造CB衍生的NK細(xì)胞以表達(dá) IL-15。因此，CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)生了它們自己的可溶性 IL-15，這足以維持42天的自主生長。然而，由于細(xì)胞因子釋放綜合征，將高劑量的表達(dá)CAR的CB衍生的 NK 細(xì)胞注入小鼠（Raji異種移植模型），在四只小鼠中被證明是致命的。為了預(yù)先排除這種致命副作用的可能性，作者還包括一個誘導(dǎo)性自殺基因作為安全措施。雖然由于IL-2和IL-15的副作用，對NK細(xì)胞輸注的全身細(xì)胞因子支持是不利的，但工程細(xì)胞分泌細(xì)胞因子似乎也不是一個簡單的解決方案。

Clinicaltrials.gov 目前有 6 個 CAR-NK 細(xì)胞試驗被列為積極招募和 6 個尚未積極招募的早期 I 期臨床試驗（表 1）。雖然許多試驗側(cè)重于淋巴瘤和白血病，但其他試驗則針對實體腫瘤，包括卵巢癌、前列腺癌、腦癌、肝癌、肺癌和胰腺癌。

已經(jīng)報道了針對 CD33 或 NKG2D 配體的 NK-92 和原代 CAR-NK 細(xì)胞的小規(guī)模臨床試驗（n=3）的結(jié)果，但第一次大規(guī)模 I/II期臨床試驗直到最近2020 年 2 月發(fā)表。11名復(fù)發(fā)性或難治性慢性淋巴細(xì)胞白血病 (CLL) 或非霍奇金淋巴瘤患者在接受環(huán)磷酰胺/氟達(dá)拉濱的標(biāo)準(zhǔn)淋巴細(xì)胞清除治療后，接受了異基因CB衍生的 CAR-NK細(xì)胞產(chǎn)品。盡管最初根據(jù)部分 HLA 匹配 (4/6) 選擇供體 NK 細(xì)胞，但 GvHD的缺失導(dǎo)致供體標(biāo)準(zhǔn)側(cè)重于 KIR 配體錯配，而沒有考慮到最后兩名患者的 HLA 匹配。不幸的是，接受KIR配體錯配產(chǎn)品的捐贈者數(shù)量太少，無法得出任何結(jié)論。

消除對HLA匹配的需求凸顯了生產(chǎn)真正現(xiàn)成產(chǎn)品的可能性，盡管產(chǎn)品在冷凍/解凍循環(huán)后的生存能力和效力仍需進(jìn)行臨床測試。CAR產(chǎn)品的短制造時間使每位患者能夠在參加臨床研究后的 2 周內(nèi)獲得單獨(dú)制造的臨床產(chǎn)品。11名患者中有 8名對治療有反應(yīng)，其中7名患者完全緩解。高反應(yīng)率和無嚴(yán)重副作用，如CRS、GvHD和神經(jīng)毒性，證明了 CAR-NK細(xì)胞作為有前途的新型癌癥免疫療法的可行性和有效性。

與之前發(fā)表的體外研究相比，在產(chǎn)生IL-15的CAR-NK細(xì)胞的上清液中檢測到IL-15水平升高，維持細(xì)胞自主生長，治療患者的血清 IL-15水平?jīng)]有超過基線水平 。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測循環(huán)中的CAR-NK細(xì)胞僅限于前14天，并且在供體之間變化很大。定量PCR用于載體轉(zhuǎn)基因的長期檢測，盡管這僅與前14天接受的治療劑量相關(guān)。雖然無法評估CAR-NK細(xì)胞療法的持久性，但由于在最初的30天后允許進(jìn)行緩解鞏固療法，對療法有反應(yīng)的患者表現(xiàn)出明顯更高的CAR-NK細(xì)胞早期擴(kuò)增。考慮到疾病的嚴(yán)重性和這些患者之前經(jīng)歷的多輪失敗的化療，11名患者中有8名的反應(yīng)率是巨大的成功。

自身MHC-I分子的抑制性受體連接通過調(diào)節(jié)溶酶體區(qū)室來微調(diào)NK細(xì)胞的功能潛力，導(dǎo)致顆粒酶B保留在細(xì)胞毒性顆粒中。接受過來自同源配體的抑制性受體輸入的受過教育的NK細(xì)胞與未受過教育的NK細(xì)胞相比，在接受足夠的激活受體輸入后表現(xiàn)出增加的功能潛力。教育幼稚NK細(xì)胞的主要抑制性受體是NKG2A和KIR。NKG2A介導(dǎo)的抑制最終在成熟過程中被更強(qiáng)的KIR介導(dǎo)的抑制所取代]。

Oei等人已經(jīng)解決了CAR信號是否足夠強(qiáng)以克服內(nèi)源性抑制信號的問題。事實上，表達(dá)CAR的NKG2A+ NK細(xì)胞能夠克服HLA-E介導(dǎo)的抑制并有效裂解721.221-AEH 細(xì)胞。然而，KIR介導(dǎo)的抑制作用并非如此，腫瘤細(xì)胞上的同源自配體表達(dá)抑制了表達(dá)CAR的NK細(xì)胞的溶細(xì)胞反應(yīng)。雖然CAR表達(dá)增加了對表達(dá)抗原的靶細(xì)胞的功能反應(yīng)，但維持了受過教育和未受過教育的細(xì)胞之間的功能層次結(jié)構(gòu)。因此，選擇功能性NK細(xì)胞起始群體對于最大化抗腫瘤效果非常有利。

CAR-T 細(xì)胞療法在臨床上對表達(dá)CD19的淋巴瘤的成功促進(jìn)了CAR-NK細(xì)胞領(lǐng)域的快速發(fā)展。T細(xì)胞和NK細(xì)胞之間導(dǎo)致細(xì)胞活化的生物學(xué)和分子機(jī)制大不相同，因此在設(shè)計 CAR-NK 細(xì)胞構(gòu)建體時需要考慮。表達(dá)CD16的 CAR-NK 細(xì)胞與單克隆抗體治療的聯(lián)合治療是通過靶點特異性裂解和ADCC充分利用NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性潛力的一種可能性。

基因工程原代 NK 細(xì)胞的挑戰(zhàn)導(dǎo)致許多研究和臨床試驗正在使用NK-92細(xì)胞進(jìn)行。新方法的開發(fā)和現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)化將促進(jìn)更有效的原代NK細(xì)胞基因工程，使原代NK細(xì)胞能夠取代目前正在臨床測試的主要 NK-92 CAR產(chǎn)品。

最后，如果持久性問題能夠得到解決，無論是通過對構(gòu)建體的額外工程設(shè)計，還是通過進(jìn)一步了解持續(xù)NK細(xì)胞增殖的要求，CAR-NK療法將具有巨大的潛力作為一種新的抗癌免疫療法。