條件培養(yǎng)基在皮膚抗衰老中的應(yīng)用

皮膚衰老是生理性、不可避免的，其具體表現(xiàn)多種多樣， 包括組織變得萎縮、脆弱，出現(xiàn)修復缺陷、免疫缺陷及易受感染。皮膚衰老受內(nèi)在及外在等多種不同因素的影響，同時在 衰老局部留下多種印記。皮膚衰老所導致的一系列不良后果， 使得人們對抗衰老的需求越來越強烈。

衰老過程包括生理和功能退化，這種退化在生物體的一生中不斷發(fā)展，由各種遺傳和非遺傳環(huán)境因素引起，最終， 體內(nèi)平衡被破壞，對疾病的易感性增加。臨床上，皮膚衰老表現(xiàn)為細紋和皺紋、彈性喪失、色素異常、表皮變薄和粗糙度增加。隨著年齡的增長，干細胞功能受損，不再維持表皮組織穩(wěn)態(tài)和修復受損組織，導致皮膚衰老。

本系列旨在科學的講述極受關(guān)注的干細胞相關(guān)抗衰老的研究進展，其中主要描述應(yīng)用較多的間充質(zhì)干細胞、誘導多能干細胞及其衍生物（外泌體、條件培養(yǎng)基、細胞外囊泡）在皮膚抗衰老中的研究成果及作用機制。

衰老是人生命的必經(jīng)歷程，皮膚是生物體最大的器官，衰老最先表現(xiàn)為皮膚衰老，其主要特征是皮膚干燥粗 糙、彈性減弱、松弛、皺紋加深等。

隨著生活水平的不斷 提高，人們比以往更加注重皮膚及身體的保養(yǎng)，對美的追 求也越來越高，因此對于皮膚抗衰老方面的研究是順應(yīng)時 代發(fā)展并具有重要的意義。

皮膚老化是一個復雜、漸進的過程，涉及外在和內(nèi)在因素，外源性老化是由于環(huán)境侵 害，包括紫外線輻射、煙霧和常見污染物，其中紫外線 輻射是外在老化的主要因素，也被稱為光老化，而內(nèi)源性老化即自然衰老，隨著老齡化現(xiàn)象的增多，如何延緩衰 老也成為研究中的焦點。

成纖維細胞是皮膚真皮中的 主要細胞類型，負責調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)、膠原蛋白產(chǎn)生和傷 口愈合。這些細胞在維持皮膚正常結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用。

間充質(zhì)干細胞在組織修復再生過程中發(fā)揮的有益作用包括刺激血管生成、抗細胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用等，大多數(shù)通過旁分泌細胞因子及外泌體等來發(fā)揮其治療效力。

條件培養(yǎng)基與上清液

基質(zhì)細胞分泌的分子是指基質(zhì)細胞分泌組，包括蛋白質(zhì)、microRNA、生長因子、抗氧化劑、蛋白酶體和外泌體，組成分泌組的基質(zhì)細胞培養(yǎng)基被稱為條件培養(yǎng)基，是豐富的旁分泌因子資源。

MSCs 分泌的因子包括各種細胞因子、生長因子及趨化因子等，存在于培養(yǎng) MSCs 的細胞培養(yǎng)液中，因此，該培養(yǎng)液也被稱為間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基(MSC-conditioned medium,MSC-CM)。

總之，條件培養(yǎng)基(conditioned medium)主要指的是將培養(yǎng)過細胞的培養(yǎng)基除細胞取其上清液，直接用于培養(yǎng)其他細胞或作為其他細胞培養(yǎng)基的添加成分的方法。

同單獨應(yīng)用干細胞相比，MSC-CM 更易于制備、凍干、 包裝和運輸。此外，MSC-CM 內(nèi)沒有細胞成分，無需匹配供體和受體，可以避免免疫排斥反應(yīng)及 倫理等問題。因此, MSC-CM 作為再生醫(yī)學的藥物具有廣闊的應(yīng)用前景。

值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)人誘導性多能干細胞產(chǎn)生的細胞外囊泡是間充質(zhì)干細胞的16 倍。

MSC-CM 的成分?

MSC-CM 中富含各種分泌因子,主 要包括生長因子、抗/促炎細胞因子及各種其它細胞因子。生長因子包括血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF2)、血小板源性生長因子、胰島素生長因子(insulin growth factor,IGF)-1/-2、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、腦 源 性 神 經(jīng) 營 養(yǎng) 因 子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF)等;抗炎細胞因子包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor,TGF-β)、白 細 胞 介 素 (interleukin,IL )-6、 IL-1 0、IL-1 3、IL-1 7 及 IL-2 7;促 炎 細 胞 因 子 包 括 IL-8、IL-9 及 IL-1β;此外,MSC-CM 中也存在粒細胞集落刺激因子、前 列腺素 E2、神經(jīng)營養(yǎng)素(neurotrophin,NT)、單核細胞趨化 蛋白-1 等。不同干細胞來源的 MSC-CM 內(nèi)富含的活性因 子成分有所不同,不同的活性因子決定了 MSC-CM 具備不 同的作用及功能。

不同來源的 MSC-CM 中主要活性成分及功能

促進各種組織器官的再生和修復

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院整形外科在 Front Cell Dev Biol.科技期刊上（下圖）發(fā)表的研究指出，間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基也含有間充質(zhì)干細胞分泌的關(guān)鍵細胞因子和生長因子，可促進各種組織器官的再生和修復，起到抗氧化、抗皺和美白的作用。

同時，該研究指出脂肪源干細胞（ASCs）是一種從脂肪組織中分離出來的重要干細胞類型，具有多線分化、易于獲得、高增殖潛力和自我更新的特性。

外泌體是細胞間交流的新前沿，調(diào)節(jié)著細胞的生物行為，如血管生成、免疫調(diào)節(jié)、增殖和遷移。

ASC衍生的外泌體（ASC-exos）是ASCs旁分泌的重要成分，具有多種生物活性。組織再生需要多種生長因子、蛋白酶、祖細胞和產(chǎn)生炎癥細胞因子的免疫細胞的協(xié)調(diào) “重要網(wǎng)絡(luò)”。

最近，作為細胞間的信使，ASC-exos受到了很多關(guān)注，因為它們是重要的旁分泌介質(zhì)，有助于組織再生。ASC-exos通過包裹各種類型的生物活性物質(zhì)而具有獨特的特性，在組織再生中具有巨大的應(yīng)用潛力，通過修復細胞的遷移和增殖，促進血管新生，以及在不同組織中的其他特定功能。

在此，研究人員闡明了ASC-exos在整形美容外科組織再生方面的研究進展，包括皮膚抗衰老治療、皮炎改善、傷口愈合、疤痕去除、皮瓣移植、骨組織修復和再生、肥胖預(yù)防、脂肪移植、乳腺癌和乳房重建。ASC-exos的生物學特性將為探索整形美容外科中組織再生的新型治療策略提供進一步的見解。

各類細胞條件培養(yǎng)基

預(yù)防皮膚外源性衰老損傷

韓國首爾CHA干細胞研究所的研究指出，制備良好的間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基在一定程度上起到了預(yù)防皮膚成纖維細胞內(nèi)源性和外源性衰老損傷的積極作用。脂肪間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基中存在的旁分泌因子( 表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β、血管內(nèi)皮生長因子) 促進皮膚成纖維細胞增殖、遷移，增加細胞外基質(zhì)、膠原蛋白的產(chǎn)生，從而改善皮膚彈性喪失等面部衰老體征。相關(guān)研究 Expert Opin Biol Ther.上（下圖）。

將ASCs和ASC-CM應(yīng)用于皮膚科顯示出皮膚再生的良好效果。

保護皮膚免受氧化應(yīng)激

韓國首爾Kangnam-Gu干細胞研究所的研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基已被證明可在體外保護皮膚成纖維細胞免受氧化應(yīng)激。相關(guān)研究發(fā)表在 J Dermatol Sci ?. 上。

該研究通過收獲ADSCs的條件培養(yǎng)基（ADSC-CM）并測試其抗氧化作用。ADSC-CM的抗氧化作用與100microM抗壞血酸一樣強，通過蛋白質(zhì)組分析在ADSC-CM中檢測到各種抗氧化蛋白。

形態(tài)學變化和細胞存活率測試顯示，用ADSC-CM培養(yǎng)有助于HDFs抵抗tbOOH誘導的自由基。

此外，經(jīng)ADSC-CM處理的HDFs的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性增強，這證實了研究中的假設(shè)：ADSCs通過抗氧化作用保護HDFs。

在細胞周期分析中，ADSC-CM處理可以逆轉(zhuǎn)tbOOH誘導的細胞凋亡，并使亞G1細胞比未處理的細胞減少。ADSC-CM的抗凋亡作用也通過caspase-3的活性檢測得到了再現(xiàn)。

這些結(jié)果表明，ADSCs具有強大的抗氧化活性，通過減少凋亡細胞來保護HDFs免受氧化損傷。因此，ADSCs和ADSC-CM是控制和預(yù)防各種皮膚狀況中自由基造成的皮膚損傷的良好候選者。

iPS細胞的條件培養(yǎng)基和外泌體治療皮膚老化方面潛力

韓國江原國立大學的研究表明，來源于人誘導性多能干細胞（iPS細胞）的條件培養(yǎng)基和外泌體改善了由紫外線光老化和自然衰老誘導的人皮膚成纖維細胞的基因型和表型變化。?相關(guān)研究發(fā)表在Int J Mol Sci ?. 上。

該研究指出，干細胞及其旁分泌因子已成為再生醫(yī)學的一種資源。許多研究表明，成人干細胞分泌的旁分泌因子，如外泌體，對皮膚老化有好處。

然而，到目前為止，很少有報告表明使用來自人類多能干細胞的外泌體來治療皮膚老化。

在這項研究中，研究人員從人類誘導多能干細胞（iPSCs）的條件培養(yǎng)基中收集了外泌體，并研究了其對老化的人類真皮成纖維細胞（HDFs）的影響。細胞增殖和存活率由MTT試驗確定，細胞遷移能力由劃痕傷口試驗和轉(zhuǎn)孔遷移試驗顯示。

為了誘導光老化和自然衰老，用UVB（315納米）照射HDFs，并分別進行30次以上的培養(yǎng)。通過定量實時PCR（qPCR）評估某些mRNAs的表達水平。衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）的活性被評估為自然衰老的標志物。

結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)來自人類iPSCs的外泌體（iPSCs-Exo）在正常條件下刺激了HDFs的增殖和遷移。用iPSCs-Exo預(yù)處理可以抑制UVB照射引起的HDFs的損傷和基質(zhì)降解酶（MMP-1/3）的過度表達。

iPSCs-Exo還提高了光老化的HDFs中I型膠原蛋白的表達水平。此外，研究人員證明iPSCs-Exo明顯降低了SA-β-Gal和MMP-1/3的表達水平，并恢復了衰老的HDFs中I型膠原蛋白的表達。綜上所述，這些結(jié)果表明iPSCs-Exo在治療皮膚老化方面具有治療巨大潛力。

此外，另有研究證明，將來源于誘導多能干細胞的高純度細胞外囊泡應(yīng)用于活性氧升高的衰老間充質(zhì)干細胞時，細胞活性氧水平降低，衰老間充質(zhì)干細胞的衰老表型減輕。值得注意的是，人誘導性多能干細胞產(chǎn)生的細胞外囊泡是間充質(zhì)干細胞的16 倍。

條件培養(yǎng)基

條件培養(yǎng)基及微針治療脫發(fā)

暨南大學附屬第一醫(yī)院整形外科的科研團隊2021年在《感染、炎癥、修復》上發(fā)表了綜述報告指出，脫發(fā)是由多種毛發(fā)生長障礙引起的疾病，對患者心理有很大影響，超過50％的人有脫發(fā)困擾 。

其中，雄激素性脫發(fā)(androgenic alopecia,AGA)和斑禿是最常見的兩種脫發(fā)類型。關(guān)于脫發(fā)的藥物治療。目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的AGA治療方法包括口服非那雄胺和局部應(yīng)用米諾地爾。

然而，藥物治療只是延緩脫發(fā)，并且有出現(xiàn)不良反應(yīng)的可能。常用于斑禿的治療方法為全身或局部應(yīng)用激素或免疫抑制劑，治療后患者常出現(xiàn)免疫抑制相關(guān)的不良反應(yīng)。利用干細胞進行生物工程再生毛囊的研究為脫發(fā)的治療提供了新的途徑。例如，脂肪干細胞條件培養(yǎng)基(adipose derived stem cell-conditioned medium，ADSC-CM)沒有細胞成分，無免疫原性，不需要進行供體-受體匹配，這使其成為一個更優(yōu)的選擇。

微針治療作為一種微創(chuàng)的皮膚病學手術(shù)，在脫發(fā)治療中的應(yīng)用也逐漸增多，且微針治療已經(jīng)成功地與其他促進毛發(fā)生長的療法例如米諾地爾、富血小板血漿和局部類固醇治療等相結(jié)合，能夠有效地刺激毛囊生長。

總結(jié)與展望

條件培養(yǎng)基是一種多生長因子的復合體，其所 具有的使用價值，是不同于以干細胞為代表的細胞醫(yī)療，也有異于單一外源性生長因子的應(yīng)用。由于誘導多能干細胞、間充質(zhì)干細胞等強大的旁分泌作用，含有大量多種生長因子的條件培養(yǎng)基的使 用價值被逐漸重視起來。?

條件培養(yǎng)基若想要在臨床上得到廣泛應(yīng)用，首先則應(yīng)規(guī)范條件培養(yǎng)基的提取程序與制度，確保條件培養(yǎng)基中所含各種成分對人體不具有潛在的安全性問題，比如動物血清對人體的影響等。此外， 在今后的研究中，對不同數(shù)量級干細胞提取的條件培養(yǎng)基各種生長因子的含量及所占比例是需要進一步確認的，且哪種干細抱是最適提取上清液濃度也是一個重要的問題；如今對條件培養(yǎng)基的儲存及儲存期限的研究并不明確，條件培養(yǎng)基在長期儲存后是否仍具有良好的生物學功能， 這對將來條件培養(yǎng)基在臨床上的推廣使用也是一 個重要的前提與條件，而從條件培養(yǎng)基中提取外泌體可能是一個重要的方向；最后，對條件培養(yǎng)基中多生長因子間的相互作用也是亟需探索的，應(yīng)從對單一生長因子的研究，逐漸發(fā)展到對多種生長因子之間 相互作用的探究。相信隨著對條件培養(yǎng)基越來越深入的探究與了解，其具有的巨大臨床使用價值將得到充分的挖掘。